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C57BL/6J小鼠
基因敲除构建设计。
条件性Pde4d基因敲除小鼠采用PCR方式进行鉴定。
引物设计
引物名称
引物序列(5’-3’)
PCR 产物大小
跑胶检测L 端floxp 插入情况
F1
GTCAGATGAAATGCTTTGCTTTC
KI:210 bp WT:176 bp
R1
TATGTTATTCCAGAGCTGCCTG
跑胶检测R 端
floxp 插入情况
F2
TCCGAGAGGAGGGCAGTTG
KI:238 bp
R2
GAGAGCTCTGATGTCTGGGACC
WT:194 bp
测序检测两端floxp 插入情况
F
TCCCTCCAGCATTATTGAGG
KI:1082 bp WT:1014 bp
R
GATCTCTACCATCCCTTACAATCC
1)F1+R1 引物PCR 检测L 端floxp 插入情况:
①纯合子(f/f):只有一条KI:210 bp 带
②杂合子(f/w):两条带,一条为KI:210 bp,一条为WT:176 bp
③野生型(wt):只有一条WT:176 bp 带
2)F2+R2 引物PCR 检测R 端floxp 插入情况:
①纯合子(f/f):只有一条KI:238bp 带
②杂合子(f/w):两条带,一条为KI:238 bp,一条为WT:194 bp
③野生型(wt):只有一条WT:194 bp 带
3)F+R 引物PCR 检测两端floxp 插入情况:
需要测序判断,测序引物为F(或R1)和F(或F2)
①纯合子(f/f):测序峰型为单峰,比对与Donor 序列一致,插入两个floxp 序列
②杂合子(f/w):测序峰型为双峰,能读出含有floxp 序列的套峰
③野生型(wt):测序峰型为单峰,比对与野生型序列一致
(2)PCR结果:见图7#、9-10#小鼠PCR结果符合要求,需进一步测序鉴定。
测序结果:将F/R 引物扩增的PCR 产物测序确认小鼠为两端精确插入floxp 序列的杂合子,具体见图3。黑色箭头代表野生型序列,红色箭头代表插入的序列,L 端和R 端测序的峰形分析,都可确认在小鼠floxp 序列(ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT)精确插入指定位置。L 端flxop 插入分析(测序引物:F)
图3. F/R 引物扩增的PCR 产物测序结果
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