帕金森疾病（PD）斑马鱼模型

斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

1. 造模化合物

1-甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，常用 于制作帕金森病动物模型。

2. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系。斑马鱼饲养和管理均按照常规方法。饲养空 间温度 28-30°C。

3. 造模化合物处理

MPTP 为 Sigma (M0896) 产品，MPTP 母液用纯水制备，浓度为100 µM， 储存于－20 °C. MPTP工作液用饲养液稀释至50、100、200、500 µM。将斑马鱼幼体暴露于MPTP 工作液24小时，收集幼体，进行下一步处理。

4. RT-PCR检测PD相关基因转录水平

收集斑马鱼于 TRIzol reagent (Sigma).提取总 RNA，进行 RT-PCR 检测 PD 相关的基因表达水平。PCR 引物见表 1。

表 1. Primer pairs and parameters of PCR in the study

5. 原位RNA杂交

收集斑马鱼于4% paraformaldehyde固定。Th基因探针片段为PCR产物（表1）， 并被克隆到载体pGEM-T质粒上。探针的合成按照试剂盒(DIG RNA labeling kit (Roche Applied Science, 1175041)）说明制备th基因RNA杂交探针。按照操作程序 将斑马鱼样本与探针温育、检测、拍照。

6. 原位免疫荧光检测

按照常规程序，将斑马鱼幼体与TH蛋白单克隆抗体(Minipore, MAB318)温 育，然后用FITC-标记的二抗温育、洗涤，显微镜下检测、拍照。

7. Western blotting

用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑马鱼总蛋白，进 行SDS-PAGE、转膜，用PD相应蛋白的抗体和二抗进行检测。β-ACTIN抗体，mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠

anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonal antibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no. 6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAb antibody (CST, catalog no. 2644)。

8. 斑马鱼行为学实验

幼体行为记录采用ZebraLab (法国Viewpoint, ZebraLab 3.3)仪器，幼体逐个放 入96-孔板，(1 fish/well). 记录运动距离、游泳持续时间、速度和游泳轨迹。每5 分钟记录一次数据。

1. 动物症状观察

与野生型斑马鱼相比，斑马鱼幼体暴露于 MPTP 后，出现类似人类 PD 患者 的行走不稳、反应迟缓、静止性震颤。PD 模型斑马鱼的游泳速度明显变缓，泳 速和游泳持续时间明显减低，甚至静止时伴有身体抖动，对触及刺激反应迟缓且

反应强度减低（图 1）。与临床症状相符。

2. 生物标志物方面：PD 的蛋白标志物 β-SYNUCLIN、PARKIN、PINK1 明显高于正常对照斑马鱼；神经元细胞标志物酪氨酸羟化酶蛋白(TH)明显减少，提示多巴胺能神经元细胞死亡数增多（图 1）。

3. 多巴胺能神经元细胞数量明显减少。但，神经元细胞内 th 基因表达强度增强，类似于人 PD 早期脑多巴胺神经元死亡后存活神经元的代偿性 TH 高表达。 （图 2）

图1. MPTP造成斑马鱼幼体运动减少，PD标志基因/蛋白水平升高

斑马鱼幼体(5 dpf)暴露于50 µM的MPTP中24小时，进行运动活性（运动距离、持续时间和速度）检测20分钟。A．散点图显示幼体运动行为的统计学变化；右侧显示一组代表性运动轨迹图(5分钟轨迹)。B–E, 斑马鱼暴露于100和200 µM MPTP 24小时后，检测PD相关的标志基因和蛋白: TH (B)、β-syn (C)、Parkin (D) 和PINK1 (E)。*, p values_0.05; **, p values_0.01; ***, p values_0.001。(one-way ANOVA)。

图 2. MPTP 导致斑马鱼幼体中脑多巴胺能神经元数量减少

A. 以酪氨酸羟化酶基因(th)反义 RNA 为探针，采用原位杂交方法检测斑马鱼幼体中脑多巴胺神经元数量和 th 基因表达强度。B. 原位荧光免疫实验检测酪氨酸羟化酶，绿色荧光斑点显示斑马鱼幼体中脑多巴胺神经元数量和分布。一抗抗体为酪氨酸羟化酶抗体。