6OHDA大鼠PD模型

6-OHDA的化学结构类似于多巴胺，可被摄入到神经元内导致多巴胺能神经元的死亡，不透过血脑屏障，需要脑内注射。6-OHDA制作PD动物模型涉及的毒理机制为：（1）6-OHDA引起大规模氧化应激反应导致神经损伤；（2）6-OHDA可抑制线粒体呼吸酶复合体活性从而抑制其呼吸链的功能，进而引起细胞凋亡；（3）6-OHDA注入黑质纹状体内介导炎性反应使之出现损伤；（4）6-OHDA可同时影响其他基底神经节的代谢活动并导致细胞内Ca2+的超载。Ungerstedt等向大鼠脑内注射6-OHDA后成功建立了PD动物模型。6-OHDA应用于小鼠、狗、猫、猴等也可建立PD动物模型，但敏感性各有差异，大鼠最敏感也最常用。选择不同的注射部位、剂量和浓度，可制成完全损伤和部分损伤模型，也可制成早、中、晚期的PD动物模型。如完全损伤模型可导致神经元发生急性坏死，模拟PD的晚期特征，但动物的死亡率很高，故常采用单侧小剂量损毁来模拟PD的早、中期特征，此方法使模型更接近于人类。此模型与人类PD在生化、病理等方面较相近，经济易行，行为学改变稳定且便于观察，是目前唯一可进行行为学量化检测的模型，为研究PD的病机与治疗（包括药物、脑移植和基因治疗等）提供了理想模型，因而得以广泛应用。但此模型仍属急性损伤模型，无路易小体的形成并可对其他神经元产生非特异性损伤。

1、模型制作

主要设备：脑立体定位仪、微量注射器、微型手持式颅钻、气体麻醉机、棉签、手术器械（持针器、手术刀柄、眼科剪、眼科镊、无菌缝合针线）

主要试剂：6-OHDA、生理盐水、75%乙醇、阿扑吗啡

材料：200g雄性SD大鼠

手术流程：

（1）将大鼠置于气体麻醉机诱导箱内麻醉平稳后，俯卧平头颅位固定于小动物脑立体定位仪上。

（2）75%酒精消毒手术部位，减去头部顶毛，再次酒精消毒。

（3）沿颅顶正中切开动物皮肤，将颅骨表面的结缔组织膜除净，使前、后囟暴露清晰，少量出血时可用无菌棉签压迫止血。

（4）用规格为10μL的微量注射器抽取5μL的6-OHDA工作液，垂直固定于脑立体定位仪上，参照Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱，选取大鼠单侧两点内侧前脑束（MFB）的注射坐标与体积为：①TB=-2.3mm，L=+1.2mm,AP=-4.4mm，DV=-8.2mm，2.5μL（7.5μg）；②TB=+3.4mm，L=+0.8mm,AP=-4.0mm，DV=-8.4mm，2.0μL（6μg）。将前囟作为标准参考点，读取并标记注射靶点。

（5）于标记处使用钻头钻开颅骨，微量注射器沿钻孔垂直进针，向注射靶点内推注6-OHDA工作液，推注速度0.5μL/min，进出针速度1mm/min，留针5min。

（6）消毒伤口，缝合皮肤，将动物置于安静保温处，清醒后自由进食饮水。

2、行为学检测

阿扑吗啡（APO）诱导旋转测试

造模手术3周后，对大鼠进行APO诱导旋转测试筛选，腹腔注射APO（0.5mg/kg）诱导大鼠向健侧旋转，每周一次，共筛选三周，将30min内旋转次数达210转以上者列为成功模型。

图 1 阿扑吗啡诱导旋转测试的大鼠行为表现

Fig1.The behavior of the rats in the APO induced rotation test.

A.大鼠向健侧旋转，首尾相接记为一圈；B.大鼠偶有刻板动作、身体轴性扭转、头与上肢来回摆动并张口等异常不自主运动。

3、免疫组织化学染色观察大鼠黑质 TH+神经元

挑取黑质部位切片进行 TH+神经元免疫组织化学染色，如图2。

图2. 正常大鼠黑质内 TH+神经元荧光染色（绿色）。