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SD大鼠
包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.
3.1.2实验仪器
仪器及耗材
生产厂商
NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪
日本滨松光子学株式会社
Vevo770小动物超声影像系统
VisualSonics
激光共聚焦扫描显微镜
Leica
透射电子显微镜
JEOL
显微注射仪
Nikon
光学显微镜
化学发光凝胶成像系统
BIO-RAD
PCR仪
组织脱水机
石蜡切片机
石蜡包埋机
冰冻切片机
电泳仪
电泳槽
Tanon
数码凝胶图像处理系统
组织匀浆机
POLYTRON
恒温培养箱
温控振荡箱
Incucell
TAITEC
离心机
Eppendorf
摇床
SCILOGEX
塑料薄膜封口机
德清拜杰有限公司
电动鼓风干燥箱
天津市泰斯特仪器有限公司
电子称量器（量程0.5g-620g）
奥豪斯仪器（常州）有限公司
电子称量器（量程0.1mg-220g）
Sartorius
4℃冰箱
海尔集团
-80℃冰箱
SANYO
-20℃冰箱
涡旋振荡器
上海沪西分析仪器厂
移液器
3.1.3实验试剂
试剂
体外转录用试剂盒
Ambion
Taq DNA聚合酶
TaKaRa
T7 转录试剂盒
Invitrogen
T4 DNA裂连接
胶回收试剂盒
Qiagen
质粒提取试剂盒
Axygen
Trizol试剂
逆转录试剂盒
DNA提取试剂盒
北京全式金生物科技有限公司
Epha4（ab157588）抗体
Abcam
GADPH
Santa Cruz Biotechnology
NC膜
Millipore
化学发光液
ImmunoCruz
蛋白质分子量标记物
Takara
蛋白酶抑制剂
罗氏
组织裂解液
Thermo
丽春红
Beyotime
BCA试剂盒
Westernblot洗液（10×）
30%Acr-Bis
SDS-PAGE电泳液
Western blot转膜液（粉剂）
TEMED
过硫酸铵
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液
1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液
琼脂
BD公司
异丙醇
北京化工厂
脱脂奶粉
内蒙古伊利实业集团股份有限公司
3.1.4模型构建流程
在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。
3.1.5Epha4敲除大鼠的建立
3.1.5.1Epha4敲除大鼠模型的建立
图 1. Epha4敲除模型构建设计方案
靶点1:
CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG
R-EPHA4-gRNA UP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC
R-EPHA4-gRNA DOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG
靶点2:
CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG
R-EPHA4-gRNA UP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC
R-EPHA4-gRNA DOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG
3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立
根据3.1.5.1获得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后续实验。
3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取
在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。
4.1Epha4敲除大鼠模型的建立
4.2Epha4敲除大鼠生存率分析
对Epha4-/-基因型和WT野生型进行生存率分析显示，WT生存正常，生存率为100%，Epha4-/-生存率下降（图3）。
图3Epha4敲除大鼠生存率分析
4.3 Epha4敲除大鼠心脏重量/体重比分析
对WT和Epha4-/-进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，2、6、9月龄Epha4-/-大鼠心脏/体重比均无明显变化（图4）。2MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.38± 0.035（%），KO大鼠0.393± 0.052（%）；6MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.352± 0.024（%），KO大鼠0.0.369± 0.035（%）；9MWT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.311± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。从形态观察发现，Epha-/-大鼠的心房与野生大鼠相比明显增大，计算心房重量与心脏重量比值（atriumweight/body weight, AW/HW）。实验结果显示，与WT相比，Epha4-/-右心房/心脏重量比显著增加，2MWT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为5.939± 1.192（%），KO大鼠为7.112± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.655± 0.541（%），KO大鼠为6.892± 0.857（%），有显著性差异（图5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.72± 0.936（%），KO大鼠为7.478± 0.681（%），差异非常显著（图5，**P<0.01）。
图 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析
图 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析
4.4 M型超声心动图检测Epha4敲除大鼠心脏的结构和功能
为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测1、2、6、9四个月龄野生和敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，自2M起，Epha4-/-大鼠射血分数明显下降，差异显著（图6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室内径、室壁均无明显变化（图6）。
注：射血分数（ejection fraction，EF）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。
4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房结构和功能
为进一步分析Epha4敲除大鼠心房的结构和功能，本研究通过核磁分析2、6、9月龄WT和Epha4敲除大鼠左右心房容积和射血分数。结果表明，与WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容积均无明显变化。但6、9月龄敲除大鼠心房射血分数与野生大鼠相比明显下降，6M组WT左房射血分数为69.763±9.918（%），KO左房射血分数为47.35±7.458（%）；WT右房射血分数为69.123±14.592（%），KO右房射血分数为39.67±7.653（%）。9M组WT左房射血分数为52.738±10.739（%），KO左房射血分数为46.637±4.487（%）；WT右房射血分数为56.978±14.281（%），KO右房射血分数为32.967±2.492（%）（图7）。
图 7Epha4敲除大鼠左右心房结构功能分析
4.6心电分析Epha4敲除大鼠心传导功能
从上面的结果我们已知，心房的改变发生在心室改变之前，为了进一步分析心房的电传导功能，我们对WT和Epha4敲除大鼠进行了心电图记录。结果显示，自1M起，敲除大鼠的心电出现了明显的改变，p波消失（图8），QRS波峰值增高，QT间期延长（图9，**P<0.01）。
图 8Epha4敲除大鼠心电图记录
图 9 Epha4敲除大鼠心电指标分析
北京中科光析科学技术研究所济南分所承诺：我们将根据不同产品类型的特点，并结合不同行业和国家的法规标准，选择适当的检测项目和方法进行分析测试，或根据您的要求进行试验分析。为了不断改进我们的工作，我们致力于提高产品质控分析、使用性能检测能力，并持续加强我们团队的科研技术。同时，我们将积极跟进新的技术和标准，以最大程度地满足您的需求和市场要求。
2023-12-21 15:33:11
