CTLA4基因敲除小鼠模型

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子CTLA4 +/-,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲除小鼠CTLA4 -/-。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除杂合子小鼠；+/+：野生型小鼠。

4.2CTLA4敲除小鼠生存率及体重变化

早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠会在出生后1月内，由于严重的自身免疫疾病死亡。我们统计了小鼠出生后的生存率及体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（图3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多，但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠（图3b），体型也更小（图3c）。

注：a：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生后8周内的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生4周内的体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后体重增长缓慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠体型对比。

图3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及体重变化

4.3CTLA4敲除小鼠组织中蛋白表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4敲除，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图4）。

图4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表达

注：+/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠。

4.4敲除CTLA4基因可导致自身免疫疾病

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡，这与我们观察到的结果相似。HE染色结果显示，CTLA4敲除小鼠表现出淋巴样细胞向非淋巴组织（如心脏、肝脏）的浸润（图5b，d）。

图5组织中淋巴细胞浸润

注：在CTLA4-/-小鼠中，淋巴细胞广泛浸润到非淋巴组织中（b, d），图中显示的是心脏（a，b）和肝（c，d）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。

1基因型鉴定

在基因水平鉴定，可以检测到纯合小鼠。

2 该基因在敲除组织部位的蛋白表达水平

对敲除小鼠组织取材，在组织器官中，无法检测到CTLA4蛋白。

3生长发育和生存率情况

该敲除小鼠在出生后3-5周内死亡，在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多，但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠。