CTLA4人源化小鼠模型

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

1CTLA4人源化小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子hCTLA4 h/m,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲入小鼠hCTLA4 h/h。

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠；h/m：ctla4人源化杂合子小鼠；m/m：野生型小鼠。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

2CTLA4人源化小鼠组织中蛋白及mRNA表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4人源化，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人，以及种属反应性为人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图3a）。结果显示，市售的种属反应性为人的CTLA4抗体无法区分人源与鼠源的蛋白。

因为市售蛋白抗体无法区分人源与小鼠源CTLA4蛋白，使用RT-PCR鉴定人源化小鼠脾细胞（CD3抗体刺激4天）中mRNA表达（图3b）。结果可见人特异性引物（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）只能扩增纯合子hCTLA4 h/h的cDNA，而小鼠特异性引物（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也只能扩增hCTLA4 m/m的cDNA，可见ctla4人源化转基因小鼠中只表达人源CTLA4的mRNA。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：Western Blot 检测CTLA4蛋白在脾和肺中的表达，CTLA4：种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体，；hCTLA4：种属反应性为人的CTLA4抗体。b：RT-PCR检测CTLA4mRNA在脾中的表达，

图3CTLA4在人源化小鼠中的蛋白及mRNA表达

3人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡。但在CTLA4人源化小鼠中，没有观察等到淋巴细胞的浸润，并且根据我们的观察结果表明，纯合的CTLA4人源化小鼠寿命正常，在10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象。因此，在纯合的CTLA4人源化小鼠中，人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。

4人源化CTLA4基因小鼠免疫系统正常。

我们利用流式细胞术检测了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各类细胞的比例，发现其外周血中B细胞（B220+）、T细胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒细胞（CD11b）和NK细胞的比例都没有明显差异。同时检测骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中免疫细胞的比例发现人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比没有差异。结果说明人源化CTLA4基因后没有改变正常生理状态下小鼠免疫系统的组成（图5）。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：流式细胞术统计不同免疫细胞在外周血中的比例。B-E：流式细胞术检测不同免疫细胞的直方图。

图4 CTLA4在人源化小鼠外周血中不同免疫细胞的比例

1基因型鉴定

在基因水平鉴定，可以检测到纯合小鼠。

2 该基因在敲除组织部位的蛋白表达水平

对人源化小鼠组织取材，在白细胞中，通过反转录PCR只检测到人源CTLA4基因的表达。

3生长发育和生存率情况

该基因人源化小鼠寿命正常，组织器官中未观察等到淋巴细胞的浸润，在出生后10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象，也未观察到生长情况异常。

4 CTLA4人源化小鼠中，CTLA4单克隆抗体伊匹木减缓肿瘤生长速度

目前批准用于临床的抗CTLA4抗体可以与人源CTLA4结合，但不会与鼠源CTLA4交叉反应[11]。为了检测建立的CTLA4h/h小鼠是否可以用于临床药物筛选，我们比较了CTLA4单克隆抗体伊匹木（Ipilimumab）在CTLA4h/h和CTLA4m/m小鼠中抑制肿瘤生长的能力。用黑色素瘤细胞系B16分别移植入CTLA4h/h和CTLA4m/m小鼠，在移植后第3、5、7天，伊匹木单抗以100μg/只的剂量进行3次腹腔注射，观察肿瘤生长至14天。在CTLA4h/h小鼠中，伊匹木单抗减缓肿瘤生长速度（图6a，b），在第14天时，CTLA4h/h小鼠中肿瘤质量低于CTLA4m/m小鼠（图6c，d）。结果显示，伊匹木单抗可以在我们建立的CTLA4h/h小鼠中发挥有效作用。

注：向CTLA4h/h（左腋下）和CTLA4m/m小鼠（右腋下）皮下注射5×105B16黑色素瘤细胞，并在第3、5、7天（如箭头所示），腹腔注射依匹木单抗100μg/只，观察并测量肿瘤直径至细胞移植后14天（a，b）。在细胞移植后14天时取出肿瘤称重（c，d）。数据表示平均值±标准误，每组6–8只小鼠。使用单因素方差分析（Dunnett’s test）进行统计。*P < 0.05, **P < 0.01。

图5在CTLA4h/h小鼠中，伊匹木减缓B16黑色素瘤生长速度