铁过载小鼠活动性结核病模型

6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠

1.1实验材料

C57BL/6N 小鼠（北京维通利华，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐铁注射液（江西创导动物保健品有限公司），血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体检测试剂盒（酶免公司），组织铁检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），普鲁士蓝染色试剂盒（Solarbio），结核分枝杆菌标准株 H37Rv（菌号为 93009，本室保存），中性罗氏培养管（珠海贝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分枝杆菌快速培养管（BD 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 铁过载小鼠模型建立

6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠随机分成阴性对照、低剂量、中剂量和高剂量 4 个小组，实验组分别腹腔注射右旋糖酐铁3.75、7.5、15 mg/次，阴性对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，3 次/周，共计 4 周。定期观察小鼠生长及精神状态，称重并记录。动物实验经本所实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准，批准号为：ZLJ2019001。

1.2.2 血清生化指标与组织铁含量测定

建模完成后将小鼠摘眼球采血，4 ℃凝结过夜，2000 g 4 ℃离心 10 min，分离小鼠血清并检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体含量。解剖取小鼠心脏，肝脏、脾脏、肺、肾脏及小肠等组织器官，称重后加 1ml 生理盐水充分研磨并裂解组织碎片，12000 g 4 ℃离心 20 min，取上清并测定蛋白浓度。 血清生化检测按试剂盒说明书进行，组织铁测定则按试剂盒测定方法计算相同蛋白浓度下各组织铁含量。

1.2.3 铁过载小鼠 Mtb 感染

SPF 级 C57BL/6N 随机分成空白对照组、空白 Mtb 感染组、中剂量铁过载模型组和中剂量铁过载模型 Mtb 感染组，每组 6 只。其中 Mtb 感染组小鼠经尾静脉注射对数生长期 H37Rv 单细胞菌悬液 100 μl（1×10 6CFU/ml），空白对照组注射等剂量无菌生理盐水。本所 ABSL-3 实验室（国卫 ABSL3-059） 正常饲喂， 观察并记录小鼠临床表现，感染后 4 周解剖小鼠。

1.2.4 小鼠组织荷菌量测定

ABSL-3 实验室动物解刨台中解剖感染小鼠，无菌取小鼠肺、脾和肝脏组织；拍照记录肺、脾和肝脏等器官大体病变情况，取小鼠左肺、脾头及肝小叶于生物 安全柜内称重，依次经 2%稀硫酸溶液、生理盐水漂洗 30 s，1 ml 生理盐水温和 匀浆后进行 10倍倍比稀释，分别取 10-3，10-4和 10-5稀释液 50 µl 均匀涂布于中性罗氏培养管内，37℃培养 4 周，计算相应的组织器官荷菌量。另取 10 -1稀释液 500 μl 接种于 BD BACTEC MGIT 960 培养系统，通过记录报阳时间进行结核菌的快速检测。

1.2.5 组织切片

HE染色与铁染色 小鼠各组织器官，10%中性福尔马林溶液固定 48 h。组织按长轴最大横切面修块、梯度乙醇脱水、石蜡包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后扫描载玻片并保存为 NanoZoomer 数字病理图像，不同视野下拍照并进行组织病理学分析。铁染色组织切片脱蜡至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸馏水充分冲洗切片5 min，入核固红染色液，淡染细胞核 10 min，自来水冲洗 5 s。常规脱水透明，中性树胶封固，晾干后拍照观察其病理形态改变及铁沉积程度。

1.3 统计学分析

SPSS16.0 进行统计学处理，结果以平均数±标准差表示。不同实验处理组之间差异比较采用单因素方差分析，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。柱形图采用 GraphPad Prism 5 软件制作。

1、 表型分析

1.1 铁过载小鼠组织形态及体重评估

铁过载小鼠外观与正常小鼠无明显区别，自主活动稳定，精神状态平稳。 解剖后正常小鼠各脏器组织表面光滑，无充血、水肿。铁过载小鼠肝脏颜色呈暗褐色，且随着右旋糖酐铁剂量增加而逐渐加深，其他脏器组织无明显颜色及形态 变化（图 1）。低剂量组、中剂量组与阴性对照组相比体重增长无显著差异。高剂量组体重增长略有减缓，且与其他剂量实验组及阴性对照组比较差异有明显统计学意义( 图 2，P ＜ 0.05)。

图 1. 不同剂量铁过载小鼠肝脏变化

图 2. 不同剂量铁过载小鼠体重增长百分比

*表示高剂量组与低剂量组、中剂量组及阴性对照组比较，P ＜0.05。

2.2 铁过载小鼠组织铁含量变化

铁过载小鼠中肝组织含铁量最高，与阴性对照组小鼠相比增加接近 7 倍。 其次，组织铁含量由高至低依次为脾脏，肾脏及小肠。高剂量组和中剂量组各脏器组织铁含量均显著高于阴性对照组（图 3，P 均 ＜ 0.05），低剂量组小鼠心脏和肺组织铁含量显著低于其他剂量组，与阴性对照组相比无显著性差异（图 3， P ＞ 0.05）。

图 3. 不同剂量铁过载小鼠组织含铁量

*表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.05；**表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.01。

2.3 铁过载血生化指标变化

铁过载小鼠分别于铁剂注射 4 周后取外周血血清进行血清铁、铁蛋白、转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体检测，结果如图 4 所示。阴性对照组和各不同剂量铁剂组小鼠血清铁水平分别为19.95 ± 5.64 μmol/L、43.00 ± 6.82 μmol/L、65.84 ± 167 9.31 μmol/L 和 108.45 ± 9.90 μmol/L，组间差异有明显统计学意义 (图 4，P 均 ＜ 0.05) 。进一步检测各组动物外周血铁蛋白水平分别为 773.82 ± 161.51 μg/L、 169 1063.68 ± 65.15 μg/L、1344.08 ± 168.57 μg/L 和 1694.73 ± 44.45 μg/L，组间差异同样有明显统计学意义( 图 4，P 均 ＜ 0.05) 。然而，各剂量组小鼠转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体水平与正常对照组小鼠相比均无显著差异（图 4，P ＞ 0.05）。

图 4. 不同剂量铁过载小鼠血清铁、铁蛋白、转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体水平

(a)：血清铁，(b)：血清铁蛋白，(c)：血清转铁蛋白，(d)：血清可溶性转铁蛋白受体。*表示各不同剂量组与阴性 对照组比较，P ＜0.05；**表示各不同剂量组与阴性对照组比较，P ＜0.01。

3、病理表型

铁过载小鼠组织HE 染色与铁染色铁过载模型中高剂量组小鼠肝脏、脾脏和肾脏组织 HE 染色均可见大量团状含铁血黄素沉积。肝细胞核固缩、溶解，胞浆内满布蛋白微粒；脾小体与红髓区界限不清；小肠及心脏组织可见部分含铁血黄素沉积，心肌纤维出现排列异常，炎性细胞浸润，充血水肿、出血等病理变化；肺部可见小数铁蛋白微粒，支气管和血管周围及其管腔内炎性细胞浸润，嗜酸性粒细胞及淋巴细胞渗出，并可见肺泡不均匀扩张，肺泡间隔断裂等。中剂量组和低剂量组仅肝脏和脾脏可见含铁血 黄素沉，且含铁血黄素沉程度与铁剂量成正相关；心脏、肺、肾脏及小肠等组织未见明显含铁血黄素沉积及炎性细胞浸入，与阴性对照组相比无明显变化（图6）。普鲁士蓝染色与组织铁含量测定结果一致，阴性对照组小鼠各组织铁染色为阴性，高剂量组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和小肠等组织大量胞外铁和胞内铁呈颗粒状、块状亮蓝色铁沉积。中剂量组肝脏和脾脏组织铁沉积较明显， 心脏、肺、肾脏和小肠仅可见小量铁沉积，均未见组织形态改变。低剂量组小鼠中心脏和肺组织则未见明显铁沉积，与阴性对照组相比无显著改变（图 7）。

图 6. 不同剂量铁过载小鼠组织 HE 染色（× 20）

图 7不同剂量铁过载小鼠各组织普鲁士蓝染色（× 20）

图 7. 结核感染铁过载小鼠肺脾肝组织病理变化（× 20）

3 铁过载结核病小鼠组织荷菌量

对中剂量右旋糖酐铁建立的铁过载小鼠模型进行 Mtb 感染试验，感染后 4 周解剖并进行肺、脾和肝脏病理分析和荷菌量检测，结果表明铁过载结核病小鼠构建成功。如图 7 所示，肺脾及肝组织病理 HE 染色中铁过载 Mtb 感染组肺组织出现多处炎症反应，呈实变趋势，其中肺泡壁增厚，肺泡腔被淋巴细胞等炎症细胞填充。结核性肉芽肿显著增加且多于空白 Mtb 感染组。脾脏白髓被结核肉芽肿病变破坏，可见炎症细胞聚集，且病变较重。同样，铁过载 Mtb 感染小鼠肝脏可见水肿、淤血，光镜下肝细胞内可见团块状铁褐色沉积，Mtb 感染后出现多个散在小肉芽肿样病变。同时，感染小鼠肺、脾脏和肝组织荷菌量比较发现，铁过载 Mtb 感染组荷菌量比空白 Mtb 感染组各靶器官较高，且具有统计学差异（图 8，P 均 ＜ 0.05）。

图 8 结核感染铁过载小鼠肺脾肝组织荷菌量分析

（一）模型的评价

本模型采用的评价主要采取以整体表观效度的评价方法，本模型分为铁过载模型和结核感染模型两部分。铁过载模型的核心指标铁过载小鼠外周血血清铁和铁蛋白水平随铁剂注射量增加而升高，转铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体无明显变化。动物各脏器组织 HE与普鲁士蓝染色结果发现，铁过载动物各脏器均出现不同程度铁沉积，且高剂量铁剂引发小鼠肝肾损伤。

结核菌感染模型的核心指标是感染期的组织病变和荷菌量，铁过载小鼠感染结核菌后，铁过载动物肺脾肝组织结核性病变严重，且荷菌量较空白 Mtb 感染组增加，综合组织荷菌量和病变指标可以评价该模型。

（二）模型的验证

通过设置对照组，判定模型的成功与否，并且本模型已至少通过3个批次的实验来重复验证，参数指标稳定。