条件性基因敲除小鼠的设计利用了位点特异性重组酶系统Cre/LoxP原理,需要在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列,得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有组织或细胞特异性表达cre的小鼠交配繁殖,以获得在特定细胞或者组织里把目的基因敲除掉的小鼠,即条件性基因敲除小鼠。
如下图:
图1 特异性敲除的原理
(二)条件敲除小鼠的繁殖和鉴定
1.收到F0和F1小鼠后,首先确认每只小鼠的脚趾编号是否吻合。
2.F0和F1小鼠由于数量较少,以后需要的动物多,与野生交配,尽量多繁殖,以备后续的研究。
3.获得小鼠后,提取基因组DNA,PCR扩增,进行基因型鉴定,并利用流式进行表型鉴定。
4.繁殖方法有多种,以下为一种举例:
首先将PD-L1Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠进行杂交,得到PD-L1Flox/-小鼠,然后将PD-L1Flox/-小鼠进行自交,得到PD-L1Flox/Flox小鼠,将雌性PD-L1Flox/Flox小鼠和带有巨噬细胞特异性表达 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠进行杂交,得到 PD-L1Flox/-with Cre小鼠,最后将PD-L1Flox/Flox小鼠和PD-L1Flox/-with Cre小鼠杂交,得到1/4的PD-L1Flox/Flox with Cre小鼠,即为巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠。