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FVB/N及C57BL/6J的FOXO3A-/-小鼠,由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组提供。
FOXO3A基因敲除FVB/N小鼠(FOXO3A+/-)由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组保存(store number:016132-UCD),雌性小鼠4只,SPF级,体重16~18g,5周龄;野生型雄性FVB/N小鼠2只,SPF级,体重16~18g, 5周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2016-0011];FOXO3A基因敲除C57BL/6J小鼠(FOXO3A+/-)由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备,雌性小鼠5只,SPF级,体重15g,4周龄;野生型雄性C57BL/6J小鼠5只,SPF级,体重18~20g, 6~8周龄,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK(京)2014-0004]。实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会(IACUC)审批,IACUC号为:MAM17002。实验动物饲养繁育和实验过程中,在不影响实验要求和实验结果的基础上,严格按实验动物使用的3R原则(减少、替代、优化)关注实验动物福利。
EDTA-K3购自Sigma公司,甲基纤维素培养基购自Stem cell Technologies公司,流式抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均购自BD Bioscience和eBioscience公司;X-RAD 225高能量生物学X射线辐照仪(美国),FACS Aria TMⅡ流式细胞仪(BD Bioscience),DX120全自动血液分析仪(ABX PENTRA),CKX41倒置显微镜(奥林帕斯)。
(二)实验方法
1.小鼠分组和照射
小鼠均分为四组:野生型小鼠对照组(WT组),FOXO3A-/-小鼠对照组(FOXO3A-/-组),野生型小鼠照射组(WT+IR),FOXO3A-/-小鼠照射组( FOXO3A-/-+IR),分别接受假照射和4Gy X-线全身照射(TBI),照射剂量率为0.9Gy/min。接受TBI小鼠于SPF级动物房中饲养,每天观察记录体重变化。
2小鼠外周血常规检测
小鼠TBI 后14d小鼠眼眶静脉丛取血,抗凝管收集外周血,全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和血小板(PLT)等指标。
3小鼠胸腺、脾脏指数测定
小鼠TBI 后14d称重安乐死,取胸腺、脾脏并称重,计算脏器指数,脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。
4骨髓细胞有核细胞计数
小鼠TBI后14d,无菌分离小鼠胫骨和股骨,剔除肌肉,注射器冲洗骨髓细胞,过滤后采用KOVA一次性计数板,显微镜下人工骨髓计数。最终细胞计数结果以每只小鼠×107个细胞表示。
5小鼠骨髓细胞表型分析
小鼠TBI后14d,收集骨髓细胞至流式管,加入Biotin标记的混合一抗抗体(CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b),孵育后洗涤并重悬细胞,加入混合二抗抗体streptavidin(percp标记)、scal-1(PE标记)、ckit(APC标记),孵育后洗涤并重悬细胞。流式细胞仪检测HPCs(Lin− c-kit+Sca1−or LSK- cells),HSCs(Lin− c-kit+Sca1+or LSK+cells)[19]在骨髓中所占的比例。
6粒细胞巨噬细胞集落形成单位(Clony forming unit-granulocyte and macrophage,CFU-GM)测定[6]
小鼠TBI 后14d安乐死,分离骨髓细胞并分组混合,每组接种40000个细胞到分装好的2ml的3534培养基中。按操作说明进行后续接种。接种细胞培养5~7d后于倒置显微镜下读取CFU-GM数,细胞数≥50为阳性集落。结果换算为每105个BMNCs中CFU-GM的个数。
7 统计学方法
对数据进行分析方差分析(ANOVA)。组间方差分析比较时,使用用于多重比较的the Student–Newman–Keuls test。两组计量资料比较时使用非配对Student's t 检验,差异P<0.05时认为具有统计学意义。所有这些分析使用GraphPad Prism软件(San Diego,CA,USA)。
1. FOXO3A缺陷小鼠受照后外周血计数检测
FOXO3A缺陷小鼠接受4GyTBI,2w后全自动血液分析仪测定外周血,发现白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、血小板(PLT)下降,与野生型小鼠变化没有差异(见表2)。
表1 FOXO3A缺陷小鼠受照后外周血计数检测( ±s,n=6)
WBC(109/L)
RBC(1012/L)
HGB
(g/L)
PLT
(109/L)
LYM
(%)
NEU
WT
3.44±0.38
8.24±0.68
124.45±8.27
792.9±48.51
85.19±8.4
7.23±2.73
FOXO3A-/-
6.34±1.51
7.57±1.18
134.00±12.04
815.00±83.09
75.95±12.42
29.92±6.95
WT+IR
0.37±0.11a
4.52±0.33a
66.92±7.88a
562.22±90.26a
78.18±8.11
12.90±4.07
FOXO3A-/-+IR
0.5±0.16b
3.53±0.41b
56.50±6.89b
494.67±132.19b
74.28±10.95
12.20±3.52
a:与WT组相比,P<0.05;b:与FOXO3A-/-组相比,P<0.05。
FOXO3A缺陷小鼠接受4GyTBI,2w后检测单侧骨髓细胞计数,发现FOXO3A缺陷小鼠低于野生型对照小鼠;受照后FOXO3A缺陷小鼠骨髓细胞计数下降幅度低于野生型对照(见表2)。
表2FOXO3A缺陷小鼠受照后骨髓细胞计数检测(±s,n=4)
×107个
11.80±3.27
7.42±2.91a
5.83±0.91a
6.75±0.87
a:与WT组相比,P<0.05。
FOXO3A缺陷小鼠免疫脏器系数与野生型对照未见差异;受照后改变未见差异(见表3)。
表3 FOXO3A缺陷小鼠免疫脏器系数(±s,n=5)
体重(g)
胸腺指数(mg/g)
脾脏指数(mg/g)
29.16±1.29
1.52±0.20
3.60±0.23
28.05±3.41
1.38±0.51
4.21±0.58
23.46±3.69a
1.35±0.29
2.22±0.91a
25.59±3.53
1.15±0.48
2.13±0.53b
骨髓细胞分型检测发现,FOXO3A缺陷小鼠体内HPCs 比例升高;接受4 Gy X 射线TBI 后14 d,FOXO3A-/-受照小鼠出现HSCs、HPCs 比例和数目下降程度,高于野生型对照。
表4 FOXO3A缺陷小鼠骨髓细胞分型检测( ±s,n=3)
HSCs比例(%)
HSCs数目(×106)
HPCs比例(%)
HPCs数目 (×106)
0.25±0.10
0.23±0.03
2.39±1.06
2.18±0.31
0.24±0.05
0.19±0.06
4.55±0.34a
2.75±0.88
0.20±0.07
0.12±0.05a
2.16±0.97
1.35±0.65
0.07±0.03bc
0.04±0.01b
1.13±0.47b
0.77±0.39b
a:与WT组相比,P<0.05;b:与FOXO3A-/-组相比,P<0.05; c:与WT+IR组相比,P<0.05。
CFU-GM检测发现FOXO3A缺陷小鼠造血祖细胞增殖能力与野生型对照没有差异;接受4Gy X 射线TBI 后14 d,FOXO3A缺陷小鼠未见明显降低(见表5)。
表5FOXO3A缺陷小鼠造血祖细胞增殖功能测定(±s,n=9)
/105cell
120.00±43.30
145.56±42.16
28.57±23.40a
148.89±49.10c
a:与WT组相比,P<0.05; c:与WT+IR组相比,P<0.05。
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