辐射诱导Fox3a缺陷小鼠造血系统损伤模型

EDTA-K3购自Sigma公司，甲基纤维素培养基购自Stem cell Technologies公司，流式抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均购自BD Bioscience和eBioscience公司；X-RAD 225高能量生物学X射线辐照仪（美国），FACS Aria TMⅡ流式细胞仪（BD Bioscience），DX120全自动血液分析仪（ABX PENTRA），CKX41倒置显微镜（奥林帕斯）。

（二）实验方法

1.小鼠分组和照射

小鼠均分为四组：野生型小鼠对照组（WT组），FOXO3A-/-小鼠对照组（FOXO3A-/-组），野生型小鼠照射组（WT+IR）,FOXO3A-/-小鼠照射组（ FOXO3A-/-+IR），分别接受假照射和4Gy X-线全身照射（TBI），照射剂量率为0.9Gy/min。接受TBI小鼠于SPF级动物房中饲养，每天观察记录体重变化。

2小鼠外周血常规检测

小鼠TBI 后14d小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。

3小鼠胸腺、脾脏指数测定

小鼠TBI 后14d称重安乐死，取胸腺、脾脏并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。

4骨髓细胞有核细胞计数

小鼠TBI后14d，无菌分离小鼠胫骨和股骨，剔除肌肉，注射器冲洗骨髓细胞，过滤后采用KOVA一次性计数板，显微镜下人工骨髓计数。最终细胞计数结果以每只小鼠×107个细胞表示。

5小鼠骨髓细胞表型分析

小鼠TBI后14d，收集骨髓细胞至流式管，加入Biotin标记的混合一抗抗体（CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b），孵育后洗涤并重悬细胞，加入混合二抗抗体streptavidin（percp标记）、scal-1（PE标记）、ckit（APC标记），孵育后洗涤并重悬细胞。流式细胞仪检测HPCs（Lin− c-kit+Sca1−or LSK- cells），HSCs（Lin− c-kit+Sca1+or LSK+cells）[19]在骨髓中所占的比例。

6粒细胞巨噬细胞集落形成单位（Clony forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM）测定[6]

小鼠TBI 后14d安乐死，分离骨髓细胞并分组混合，每组接种40000个细胞到分装好的2ml的3534培养基中。按操作说明进行后续接种。接种细胞培养5~7d后于倒置显微镜下读取CFU-GM数，细胞数≥50为阳性集落。结果换算为每105个BMNCs中CFU-GM的个数。

7 统计学方法

对数据进行分析方差分析（ANOVA）。组间方差分析比较时，使用用于多重比较的the Student–Newman–Keuls test。两组计量资料比较时使用非配对Student's t 检验，差异P<0.05时认为具有统计学意义。所有这些分析使用GraphPad Prism软件(San Diego，CA，USA)。

骨髓细胞分型检测发现，FOXO3A缺陷小鼠体内HPCs 比例升高；接受4 Gy X 射线TBI 后14 d,FOXO3A-/-受照小鼠出现HSCs、HPCs 比例和数目下降程度，高于野生型对照。

表4 FOXO3A缺陷小鼠骨髓细胞分型检测( ±s，n=3)

a：与WT组相比，P<0.05；b：与FOXO3A-/-组相比，P<0.05; c：与WT+IR组相比，P<0.05。