肠道病毒71人清道夫受体B2（hSCARB2）转基因动物模型

SCARB2转基因动物模型，无特定病原体(specific-pathogen free，SPF) ICR小鼠，6周龄，雌性，体重18-20g。

背景品系为ICR封闭群小鼠，Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标，进行选育，以后美国癌症研究所（Institute of Cancer Research）分送各国饲养实验，各国称为ICR。

pCMV6-XL5-h-SCARB2质粒购自美国Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)质粒中巨细胞瘤病毒（CMV）启动子下游，构建全身表达人SCARB2的载体。转基因载体经测序验证后，用Pvu I将载体线性化，Sephedex G50柱纯化。将DNA浓度调整至5ng/uL，用显微注射法将DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。经鼠尾DNA PCR对首建鼠的基因型进行鉴定，得到阳性首建鼠3只（图1A）。随后，用逆转录PCR分析了首建鼠F1代组织中目的基因的表达情况，发现人SCARB2主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达（图1B）。随后，分别用Western Blot和免疫组化分析了人SCARB2蛋白在脑和骨骼肌组织中的表达情况。由于人SCARB2与小鼠SCARB2同源性较高，存在抗体交叉结合现象。Western Blot发现转基因小鼠脑和骨骼肌组织中SCARB2蛋白表达量高于同窝阴性（图1C-1D）。免疫组化发现SCARB2蛋白主要分布于转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中（图2A-2B），该结果表明成功建立了脑和肌肉组织表达人SCARB2蛋白的转基因小鼠。

图1 人SCARB2转基因小鼠的构建及鉴定注：M：DNA分子质量标准；1-15：首建鼠；NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠；A：PCR鉴定阳性首建鼠；B：逆转录PCR分析转基因小鼠组织内人SCARB2基因表达；C：Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠脑组织中的表达，GAPDH为内参；D：Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠骨骼肌组织中的表达，GAPDH为内参。

Note: M: DNA molecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenic mice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNA as template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 gene expression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDH expression

Fig.1 Establishment and identification of the transgenic miceexpressing human SCARB2.

注： NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠；A-B：21日龄小鼠脑和肌肉的免疫组；SCARB2蛋白如黑色箭头所示。放大倍数为：100×。

图2 SCARB2转基因小鼠的免疫组化鉴定

Note: NTG: Negative littermates; TG: transgenic mice; A-B:immunohistochemicalanalysis of brain and muscle of 21-day TG mice and the positions of SCARB2 protein aredenoted with black arrows,respectively. Magnification: 100×.

Fig.2Immunohistochemical identification of the SCARB2 transgenic mice

为研究表达人SCARB2对EV71感染转基因小鼠的促进作用。我们分别用MP10毒株感染不同年龄段的小鼠，发现两周龄以下的转基因小鼠和野生型小鼠在感染病毒后，会于10天内死亡，肌肉组织内病毒载量超过108拷贝/毫克，转基因小鼠与野生型小鼠在病毒复制方面差别不大。因此，我们用２×１０６ＴＣＩＤ５０MP10毒株200uL分别感染了21日龄的转基因小鼠和野生型小鼠，主要研究了表达人SCARB2受体组织内的病毒复制情况。发现在感染后3天（病毒复制的最高峰）转基因小鼠骨骼肌和脑中EV71的拷贝数显著高于同窝阴性小鼠（图3A-3B），随后，用免疫组化研究了组织内的病毒分布情况。EV71抗原主要分布于转基因小鼠的脑组织中，而野生型小鼠脑组织中未检测到病毒抗原（图4A）。转基因小鼠骨骼肌组织内均分布着大量的EV71抗原，与和野生型小鼠比两者间差异明显（图4B）。表明表达人SCARB2可促进EV71对转基因小鼠组织的感染，证实该蛋白在体内可发挥EV71受体的功能。

图3EV71感染转基因小鼠注：A：EV71感染小鼠3天后脑中病毒载量。B：EV71感染小鼠3天后肌肉中病毒载量。* p<0.05 和 *** p<0.001

Note:A: viral loadof brain of E71infected miceat 3 days post infection. B: viral loadof muscle of E71infected miceat 3 days post infection. * p<0.05 and *** p<0.001

Fig.3 EV71 infect transgenic mice

注：A-B：EV71感染后21日龄小鼠脑和肌肉的免疫组化，细胞内病毒抗原如黑色箭头所示。放大倍数为：100×。

图4EV71感染转基因小鼠的免疫组化鉴定

Note: A-B: immunohistochemicalanalysis of brain and muscle of EV71infected 21-day mice and the positions of intracellular viral antigens aredenoted with black arrows,respectively. Magnification: 100×.

Fig.4 Immunohistochemical identification of the EV71 infect transgenic mice