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C57BL/6小鼠,1921年被培育出来,属于近交品系。最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖,且是第一个完成基因组测序的小鼠品系。主要用途有如下三个方面:
作为生理学与病理学的实验动物模型
构建转基因动物模型,保证遗传背景上的高度稳定性和实验数据的一致性。
作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。
购买ES 细胞克隆XG183,该克隆中一个基因捕获载体(SA β -geo)被插入Gorab 基因第一个内含子中(图1)(购自BayGenomics 公司,USA)。按照说明书的相应标准和程序培养ES 细胞,并进行囊胚(C57BL/6)注射,然后通过胚胎移植将注射后的囊胚移植入代孕母鼠体内;将得到的嵌合体小鼠与亲本小鼠(C57BL/6)进行回交,得到F1 代小鼠。捕获载体的表达干扰了Gorab 基因的剪接,最终出现Gorab 第一外显子和β -geo 的融合表达。
图1:Gorab基因打靶策略和预测转录本
1. 基因型检测和蛋白表达检测
提取小鼠基因组DNA,用PCR 扩增插入的β -geo 基因,鉴定捕获载体是否插入小鼠基因组,同时检测插入位置的第一内含子片段,鉴定突变纯合子和突变杂合子(图2A)。取E18.5 天的胚胎进行PCR 检测,得到纯合子小鼠,且野生型小鼠、杂合子小鼠和纯合子小鼠的比例符合孟德尔遗传定律。取E18.5 天的小鼠胚胎,提取不同组织(表皮、真皮、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑、骨骼肌)的总蛋白,使用Western blot 的方法检测Gorab 蛋白的表达,确认了纯合子的缺失突变(图2B)。
图2:A:PCR鉴定Gorab基因缺陷小鼠的基因型(M:DNA分子量标记;1-3: Gorab基因缺陷纯合子小鼠;4-6: Gorab基因缺陷杂合子小鼠;7-9: 野生型小鼠;P:阳性对照;N:阴性对照;B:空白对照)。B:Western blotting检测Gorab在不同组织内的表达(1-8泳道的组织样品分别为:表皮、真皮、心、肝、肺、肾、脑、骨骼肌)。
2. Gorab基因敲除小鼠的外观及皮肤和骨组织的组织学改变
繁殖存活的小鼠中未检测到Gorab-/-小鼠,提示Gorab-/-小鼠可能于胚胎发育期或围产期内已经死亡。Gorab+/-小鼠互交查阴栓推断胚胎日龄,取18.5天的胚胎进行PCR检测,得到Gorab-/-小鼠,且Gorab+/+小鼠、Gorab+/-小鼠和Gorab-/-小鼠的比例符合孟德尔遗传定律,推测Gorab-/-小鼠可能于围产期死亡。观察孕鼠生产,见小鼠出生后,Gorab-/-小鼠不能正常呼吸,且在出生后几分钟内死亡,Gorab-/-小鼠可能存在肌肉骨骼系统和呼吸系统的缺陷。
观察18.5天的小鼠胚胎,Gorab-/-小鼠的大小与Gorab+/+小鼠或Gorab+/-小鼠的大小相类似,没有显著差异。但Gorab-/-小鼠呈弓背姿势,正常脊柱弯曲消失,腹侧面皮肤紧绷导致躯体伸展受限,头圆,口鼻部突出等颅面部畸形,四肢短,腹部膨隆,皮肤褶皱较Gorab+/+小鼠或Gorab+/-小鼠少,表皮发亮(图3A)。这些表型改变提示其皮肤和骨骼的结构异常。
将18.5天的小鼠胚胎整体包埋,石蜡切片HE染色,观察皮肤和骨骼和肺的形态变化。Gorab-/-小鼠较Gorab+/+小鼠表皮基底细胞层平坦,未见上皮脚及毛囊原基,真皮层明显水肿,皮下肌层较薄(图3B);软骨成熟区和钙化区变窄,骨组织过早钙化(图3C);肺泡间隔增宽,肺泡腔狭窄(图3D)。
图3:A:胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠的外观。B:胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠腹部皮肤的组织学表现(HE染色),Bar=100μm。 C:胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠股骨的组织学表现(HE染色),Bar=200μm。D:胚胎18.5天野生型小鼠和纯合子小鼠肺的组织学表现(HE染色),Bar=50μm。
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