脑室注射Aβ或脂多糖模型

大鼠（体重260-300g），主要品种有SD和Wistar大鼠；小鼠（体重25-30g），主要品种有C57BL/6、ICR和Swiss albino小鼠。多用雄性，亦有雌雄各半。

1、药品与试剂

Amyloid β 蛋白片段1-40（也有采用Aβ1-28、Aβ1-42或者Aβ25-35）；水合氯醛（或其它麻醉药物如戊巴比妥钠）；无菌生理盐水（或PBS或双蒸水）；H2O2溶液；青霉素钠粉。

脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，临用前配制成不同浓度备用，通常使用无菌生理盐水或人工脑脊液稀释，根据实验要求进行选择；麻醉药物水合氯醛或戊巴比妥钠；30% H2O2溶液；青霉素钠粉末或注射液。

2. 实验仪器

脑立体定位仪、微量注射泵、微量注射器、手术剪、手术镊子、缝合针线等。

3. 实验方法

3.1. 药品制备

Aβ1-40溶液：临用前将Aβ1-40溶于无菌生理盐水（或PBS或双蒸水）中配制成1 μg/μL母液，置于37 ℃孵育7天，使其聚集、老化，分装后，-20 ℃保存备用；

10%(m/v)水合氯醛溶液：称取水合氯醛10g，加入生理盐水定容至100 mL，备用。

3.2. 手术（以大鼠为例，小鼠操作参照此进行）

（1）定位参照George Paxinos的脑立体定位图谱及预实验结果，基本步骤如下：

（2）动物称重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉；

（3）将大鼠头顶局部用动物去毛器去毛，消毒，并固定于脑立体定位仪上；

（4）大鼠头顶处正中矢状切口，使用眼科剪剪开切口长约2cm，用棉棒沾少许H2O2清除骨膜，并用手术刀片将残物刮除干净暴露十字缝，确定前后囟，并使之处于同一平面；

（5）坐标定位

大鼠：

海马：取前囟后AP：-3.3 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±2.0 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：3.0 mm （如图1A）；

侧脑室：取前囟后AP：-0.9 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±1.5 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：3.8 mm（如图1B）；

小鼠：

海马：取前囟后AP：-2.46 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±2.2 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：2.1 mm （如图2A）；

侧脑室：取前囟后AP：-0.3 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±1.0 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：2.5 mm（如图2B）；

（以上坐标为较常见值，亦有许多其他坐标，实验坐标值以自己预实验结果为主。）

（6）将微量注射器固定于注射泵臂上，缓慢插入钻孔，单侧海马注射Aβ1-40溶液5 μL，注射速度为1 μL/min，留针5min后缓慢撤针；

（7）注射完毕后将青霉素钠盐少许撒于创口处缝合皮肤。

（8）动物手术后观察5-7天，剔除状态不好的动物。

4、行为实验

动物手术后观察5-7天，剔除状态不好的动物。利用行为学设备开展学习记忆行为实验检测。

A

B

图 1 大鼠脑立体定位图

（CA1-3海马CA1-3区，LV侧脑室）

A

B

图 2 小鼠脑立体定位图

（CA1-3海马CA1-3区，LV侧脑室）

图 3 大鼠海马立体定位注射实物图

5. 注意事项

（1）模型建立应严格按照定位图谱进行，撤针时要求缓慢（5min），以防注射的注射药物通过针道溢出；

（2） 采用冰冻切片，有利于快速病理染色以证实是否到达注射点；

（3）取材时应取前囟后2～5 mm脑组织冠状切片，以防止取材过多或错过注射点。

6. 模型分析指标

6.1 水迷宫

圆形迷宫直径为159cm、高50cm，池中水深25. 5cm 左右，内置平台直径9cm、高24cm，水温维持在( 24 ± 1) ℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个试验周期内保持环境信息固定不变。将迷宫均分为4个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余3个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练3次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从3个象限入水) ，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应10s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为90s 后，将动物放入水中，若动物在90s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息10s。若动物在90s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为90s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留10s。每只动物训练的时间间隔为40min。每天每只动物3次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过5d的训练学习后，第6天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在90s内穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

6.2 被动回避实验

实验包括获得、巩固两个部分

（1）避暗获得实验：睡眠干扰第27天进行避暗获得实验。实验前每只小鼠面向拱门由明室放入，适应3min。然后开始学习，将小鼠由明室背向拱门放入，当其进入暗室时，给予0.5mA（5s）的电击，共学习5min。

（2）巩固实验：获得实验24h后进行避暗巩固实验，仍将老鼠按原方式由明室放入，记录5min内的错误次数、进入暗室的潜伏期、在暗室停留时间等指标。实验后将老鼠取出，放回笼中。

1. 脑室注射Aβ对水迷宫的影响

正常组与假手术组动物的寻台潜伏无显著性差异（P> 0.05），且接近；与正常组相比，模型组day1-day5寻台潜伏期显著性增加（P<0.05），穿台次数显著性减少（P<0.05）。

图4脑室注射Aβ对水迷宫寻台潜伏期的影响

图5 脑室注射Aβ对水迷宫穿台次数的影响

2. 被动回避实验

暗室潜伏期，正常组和假手术组无显著性区别（P> 0.05），与假手术组相比，模型组暗室潜伏期显著性下降（P< 0.05），错误次数模型组比假手术组有所增加，但无显著性差异（P> 0.05）。