小鼠乳头瘤病毒皮肤感染模型

SPF级6-8周龄NU/NU nude mouse，雌性购自北京维通利华实验动物技术有限公司。该品系小鼠来源于NIH，科学名称Crl: NU-Foxn1nu，为无毛、白化背景，因携带Foxn1nu突变，胸腺发育不良，不能产生T细胞。

1. 小鼠尾部MmuPV1感染

三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤体重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反复轻轻刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×108 VGE）滴加到刮擦过的尾部。每周观察2次，待尾部病变直径接近1cm时，安乐小鼠并收集肿瘤。部分肿瘤组织置于福尔马林固定液用于组织学研究；部分肿瘤组织置于液氮中速冻，并保存于-80℃进行后续感染和分子研究。

2. 小鼠尾部MmuPV1DNA提取

使用分离柱法分离组织DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）。提取方法如下：将25mg切成尽量小块置于1.5ml EP管中，加入180μlBuffer ATL及20μl Proteinase K，震荡混匀，56℃孵育1-3h至增生组织完全裂解，孵育期间间断震荡；震荡15s，加入200μl Buffer AL，震荡充分混合，加入200μl无水乙醇，再次充分震荡混匀；混合物转移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000rpm）离心3min，弃废液；将珠子置于新的1.5ml或2ml离心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室温静置1min，≥6000×g（8000rpm）离心1min。

3. 小鼠尾部MmuPV1的PCR检测

将小鼠尾部增生组织置于PBS中，利用匀浆器高速匀浆3min。匀浆液10，000rpm离心3min，将上清液转移到新1.5ml EP管中。配置反应体系，上下游引物分别为对MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`-GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40个循环；68℃ 10min。

4. 小鼠尾部MmuPV1感染组织病理学检测

安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。

5. RNAscope原位杂交

安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤置于10%多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片，切片进行后续RNAscope原位杂交，具体实验步骤如下：

（1）载玻片脱蜡：60℃烤片1h，二甲苯脱蜡2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水纸上，室温静置干燥5min；

（2）双氧水靶标修复：切片滴加约5-8滴RNAscope®双氧水，室温孵育10min，蒸馏水清洗切片3-5次后，将载玻片浸没到煮沸的1×RNAscope®靶标修复液中放置15min，蒸馏水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室温静置干燥；

（3）画疏水圈：使用ImmedgeTM疏水笔在样本周围化疏水圈2-4次；

（4）将载玻片置于HybEZTM载玻片架中，滴加5滴RNAscope®蛋白酶plus，放入HybEZTM湿盒，放回40℃杂交炉 30min。蒸馏水洗3次；

（5）探针杂交：载玻片滴加4滴E1^E4探针，再放入湿盒，杂交炉40℃孵育2h，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（6）杂交Amp1：载玻片上滴加4滴Amp1，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（7）杂交Amp2：载玻片上滴加4滴Amp2，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（8）杂交Amp3：载玻片上滴加4滴Amp3，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（9）杂交Amp4：载玻片上滴加4滴Amp4，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（10）杂交Amp5：载玻片上滴加4滴Amp5，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（11）杂交Amp6：载玻片上滴加4滴Amp6，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min；

（12）信号检测：弃掉液体后，载玻片上滴加120μl DAB工作液，室温静置10min，去除DAB工作液，蒸馏水洗3-5次；

（13）载玻片复染：载玻片放入苏木精染色液中，室温静置2min，蒸馏水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸馏水再洗3-5次；

（14）载玻片脱水：载玻片放入70%乙醇，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，二甲苯溶液，室温静置5min；

（15）封片：载玻片风干后，滴加1滴Cytoseal封片剂，盖上盖玻片，风干载玻片5min。

6. 转录组差异分析

TRIzol法提取尾部增生皮肤（实验组）及尾部正常皮肤（空白对照组）样本RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop进行RNA浓度和纯度检测。送到北京诺禾致源科技股份有限公司测序平台进行RNA测序。通过文库构建并测序获得原始测序序列后进行信息分析流程，主要由两个阶段：a）评估测序数据质量；b）信息挖掘及分析。将实验组与对照组RNA-seq序列进行对比，鉴定分析差异基因表达和聚类分析（包括差异基因数目统计、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR软件进行表达差异显著性分析。

1. NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1观察

肉眼观察可见，感染后4周左右部分小鼠尾部皮肤即出现轻微增生，16周后可观察到明显病变（图1）。

图1 MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部增生模型

2. NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 DNA检测

MmuPV1感染尾部提取总DNA，利用对MmuPV1 E2基因特异性引物扩增鉴定MmuPV1表达。结果表明， 9只感染MmuPV1的小鼠尾部均建立MmuPV1持续感染，并可检测到MmuPV1 DNA（图2）。

图2感染小鼠尾部MmuPV1 E2基因PCR鉴定

1-9：MmuPV1感染小鼠尾部DNA；10：MmuPV1质粒（阳性对照）；

11：未感染小鼠尾部DNA（阴性对照）；12：水（空白对照）；

M：Trans 2k Plus DNA Marker

3. NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1后的病理学变化

用MmuPV1感染NU/NU小鼠尾部，16周后出现明显增生，收集增生部位用10%福尔马林固定，苏木精伊红染色（HE染色）后进行病理分析。组织学观察可见感染的小鼠尾部表面鳞状上皮增生（图3）。因为MmuPV1 E1^E4转录本存在于大多数乳头瘤病毒早期和晚期转录过程，即利用RNAscope原位杂交检测MmuPV1 E1^E4转录本表达，发现尾部增生部位转录本的表达为明显阳性（棕色）（图4A），而阴性探针组未检测到信号（图4B）。

图3MmuPV1感染小鼠尾部病变HE染色分析（100X）

图4 RNAscope原位杂交检测感染小鼠尾部病变MmuPV1 E1^E4转录本

A： RNAscope原位杂交E1^E4转录本检测；B：RNAscope原位杂交阴性探针对照

4. NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1转录水平差异表达分析

NU/NU小鼠尾部感染MmuPV1 16周后，尾部增生皮肤（实验组Tail）及尾部正常皮肤（空白对照组Tail C）差异基因表达分析。结果表明，与对照组比，实验组有2653个基因表达上调（红色点），2306个基因表达下调（绿色点），蓝色点表示未发生显著变化的基因，其中横坐标表示基因表达的倍数变化（log2FoldChange），其中绝对值越大表明，与对照组相比，实验组表达变化倍数越大；纵坐标表示表达差异的显著水平，Y轴1.3附近虚线对于Pvalue＝0.05（图5A）。根据GO富集分析（图5B），差异基因主要与皮肤上发育、核糖体合成、嘌呤核苷酸代谢等生物进程有关；将差异基因进行KEGG功能富集到癌症信号通路、核糖体合成相关信号通路等，说明其可能直接或间接参与MmuPV1感染尾部皮肤后病变的发生（图5C）。

图5MmuPV1感染小鼠尾部转录水平差异表达

A：差异表达基因火山图；B：GO富集分析结果；C：KEGG通路富集分析结果

MmuPV1感染小鼠模型的评价方法包括皮肤观察、病理检测、RNAscope原位杂交、PCR方法等；采用的仪器设备定期检验，条件稳定，满足模型评价的要求。