MBP敲除大鼠（MBPCre大鼠）

实验所用大鼠为SD（Sprague Dawley）背景。1925年由美国Sprague dawley农场用Wistar培育而成。特点是头部狭长，尾长接近身长，产仔多，生长发育比wistar快，抗病能力尤其对呼吸系统抵抗力强，自发肿瘤率低，对激素感受性高。该品系在国内使用频率高，价格相对便宜。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型SD大鼠为成年8-10周龄大鼠。实验中基因工程大鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

利用CRISPR/Cas9技术制备MBP敲除大鼠。在MBP基因起始密码子之前插入Cre重组酶，来构建MBP-Cre大鼠(SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS)。该模型与Cre报告大鼠进行杂交(SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS)，可以检测MBP基因的表达图谱，同时通过杂合子交配的方式可以获得该基因敲除的纯合子大鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行蛋白水平敲除效率的鉴定。

3.1.5 MBP-Cre大鼠的建立

3.1.5.1 MBP-Cre大鼠模型的建立

1. 设计方案

图 1. MBP-Cre大鼠模型构建设计方案

2. 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

R-Mbp-EA-gRNAup: TAGGTGCCCACCCAGCTGACCC

R- Mbp-EA-gRNAdown: AAACGGGTCAGCTGGGTGGGCA

GGCGCTTCTTTAGCGGTGAC AGG

R-Mbp-EB-gRNAup: TAGGCGCTTCTTTAGCGGTGAC

R- Mbp-EB-gRNAdown: AAACGTCACCGCTAAAGAAGCG

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

3. 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
4. 显微注射

1. 超数排卵：10-15只3周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
2. 受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。
3. 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
4. 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。

5. 基因型鉴定

1. 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2. 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
3. PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

6. 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
7. 根据测序结果确定MBP-Cre模型大鼠（SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型大鼠进行杂交，进行基因修饰大鼠传代能力分析。该模型包含Cre重组酶，可以同时与Cre reporter大鼠（SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到imCherry/MHC-Cre大鼠，进行表达图谱分析。之后MBP-Cre大鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得MBP-Cre纯合子大鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

图2. MBP-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。

1. 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
2. 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
3. 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
4. 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
5. 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
6. 重复步骤（5）一次。
7. 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
8. 重复步骤（7）一次。
9. 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
10. 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

4.1MBP-Cre大鼠模型的建立

利用CRISPR/Cas9在MBP的起始密码子之前插入Cre重组酶元件。出生的小鼠经过设计的包含同源臂的引物（Table1），进行基因型鉴定，并进行插入序列的测序，最终获得了正确基因插入的大鼠图3-a所示。随后，我们通过杂合子杂交的方式获得了MBP-Cre双阳的大鼠，我们分析了1月龄大鼠体重和脏器发育相关指标，图3-b，c，d，e显示，双阳性大鼠在生长发育过程中，存在明显的生长停滞显现。各个脏器相比于野生型大鼠存在明显的减小。结果表明Cre的插入造成了的基因的突变。

随后我们进行了western blot表达分析，结果显示该基因的表达在大脑和脊髓中都没有表达图3-f所示，表明Cre的插入破坏了MBP基因的表达，该大鼠可以作为一个MBP敲除大鼠模型。

图3 MBP-Cre大鼠的建立

Table 1 本文中用于基因型鉴定的引物信息

4.2MBP在大鼠脑组织中的表达分析

由于在该基因起始位置插入了Cre重组酶，该重组酶的表达利用MBP内源启动子，因此，Cre的表达能够代表MBP基因的表达图谱。我们通过将MBP-Cre大鼠与与Cre reporter大鼠（SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到imCherry/MHC-Cre大鼠，进行表达图谱分析。结果如图4所示，表明MBP在大脑中存在着非常特异的的表达图谱。

图4 MBP-Cre介导的mCherry表达图谱

4.3MBP敲除大鼠的出生情况统计

我们对该基因敲除大鼠的出生情况进行了统计，结果表明该基因敲除不影响生殖，通过杂合杂交的方式，敲除大鼠和野生型大鼠的出生比例基本一致，符合孟德尔自由分离和自由组合规律（Table 2所示）。

Table 2MBP敲除大鼠出生情况统计

WT：wild type; KO: knockout; HET:Heterozygous

4.4MBP敲除大鼠的生存率分析

上述结果表明我们成功建立了MBP敲除大鼠，并且该敲除大鼠表现为生长发育迟滞，后期伴随后肢瘫痪。随后我们对MBP敲除大鼠进行了生存率分析，图3-f所示，结果表明该基因敲除在40天左右开始出现死亡，在100天时死亡率到达80%以上。

4.5MBP敲除大鼠脑和脊髓中髓鞘相关蛋白的表达情况分析

我们对1月龄MBP敲除大鼠，进行脑组织和脊髓组织取材，分析了大脑和脊髓组织中髓鞘相关基因的表达情况。引物见Table 3所示，表达情况如图5所示。结果表明Plp1、Cnp、Pmp22在脑组织和脊髓组织表达都有明显降低。Mpz基因在脊髓中表达明显降低，但在大脑中表达反而升高，Mag的表达在脑中变化并不明显，但在脊髓中表现为表达降低。这样该基因的敲除小鼠存在一定的差异，表明该大鼠可以作为新的模型，与小鼠、人类该类疾病进行比较医学研究。

Table 3 Realtime PCR引物

图5 髓鞘相关蛋白在脑和脊髓中的表达情况分析

4.6MBP敲除大鼠行为学分析

MBP基因敲除后，在10日龄左右，开始表现出颤抖和运动平衡障碍，一直持续要死亡，或最后演变为多发性硬化。我们对1月龄大鼠进行了视频拍摄，具体如图6所示（视频）。我们并对月龄左右的敲除大鼠进行了运动能力的测试，如图7所示。

图6 MBP敲除大鼠运动视频

图7 MBP敲除大鼠的行为学检测

4.7MBP敲除大鼠MRI检测分析

对40天和60天的MBP敲除大鼠和野生型大鼠进行了MRI分析，如图8所示。T2-weighted数据显示，在胼胝体位置MBP敲除大鼠高于野生型大鼠。

图8 MBP敲除和野生型对照在40天龄和60天龄的MRI分析

4.8MBP敲除大鼠利用18F-FDG进行PET/CT影响分析

我们利用18F-FDG进行脑糖代谢能量标记，进行PET/CT分析，如图9所示。结果表明18F-FDG在下丘脑和海马中的吸收相比于野生型有明显的降低。

图9 18F-FDG进行脑糖代谢能量标记的PET和MRI影像图