PON1基因敲除大鼠

SD大鼠

1. 实验材料

1.1实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2主要实验仪器

Nikon显微注射仪

Nikon光学显微镜

BIO-RAD电泳仪

Tanon电泳槽

Tanon数码凝胶图像处理系统

Incucell恒温培养箱温控

TAITEC振荡箱

Eppendorf离心机

Eppendorf移液器

2.实验操作规程和动物处理伦理

模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003，简要步骤如下：

2.1供卵雌鼠超排

实验第一天8：00 腹腔注射PMSG30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，实验第三天10：00 腹腔注射HCG 30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即与与种鼠1：1合笼。实验第四天8：00～9：00检查阴道栓，有阴道栓的大鼠在大鼠标牌上注明日期和⊕（阳性），捡出有阴栓的大鼠进行受精卵的收集。

2.2受精卵的收集

2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱颈处死，解剖大鼠，找到卵巢，输卵管和子宫，将卵取出，用透明质酸酶消除胚泡的黏着，使卵分离。在移换到另外的培养液中，要将透明质酸酶充分洗净（洗约3~5次）。

2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液

2.4. 仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，移植到假妊娠大鼠输卵管中。术后将大鼠置于安静的环境下饲养。

2.5 基因表型鉴定

在判定有导入基因大鼠之后，立即将基因修饰大鼠另行饲养，对不用的大鼠进行处理。阴性大鼠的处理：（1）留和阳性大鼠等量的阴性大鼠对照。（2）剩余的阴性大鼠用于其它符合动物伦理的其他实验室的实验（保存记录）。

3. PON1基因敲除靶点设计与测序鉴定

利用CRISPR/Cas9 技术建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶点位于第四外显子。通过显微注射成功获得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小为342bp，能够稳定传代。PON1 杂合子大鼠之间杂交得到同窝阴性对照大鼠和敲除纯合子用于实验研究。大鼠模型资源详见（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）

图1PON1基因敲除设计策略

1. PON1基因敲除大鼠的蛋白表达鉴定

图2 PON1在脑和小胶质细胞中的蛋白表达水平鉴定

1. 2.PON1蛋白在基因敲除大鼠的胸腺组织表达缺失

图3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表达水平鉴定

2. PON1敲除降低LPS诱导致死率

图4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验中的生存率分析

3. PON1 敲除降低LPS诱导后血清中的TNF-α水平

图5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验血清的ELISA分析

4. PON1敲除诱导小胶质细胞向M2型转化

图6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神经小胶质细胞免疫组化分析

5. PON1 基因敲除可使小胶质细胞产生抑炎、促吞噬的表型。

5.1 PON1敲除大鼠小胶质细胞吞噬功能增强

图7 PON1对小胶质细胞吞噬功能的调节

5.2 PON1 敲除降低LPS诱导的促炎性细胞因子分泌

图8 利用Luminex 和ELISA方法检测细胞上清中细胞因子的分泌水平。

6. PON1敲除导致胸腺变小，胸腺细胞减少

图9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺细胞对比分析