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FVB/NJ品系基因敲除小鼠。
我们采用CRISPR-Cas9技术编辑小鼠基因组。表1中显示了小鼠基因组中指导RNA的靶标。我们混合了向导RNA和Cas9 mRNA(每个RNA 10 ng /μl),注射到FVB / NJ品系小鼠的合子(每次注射编辑200个细胞)。取得F0小鼠后,与野生型FVB / NJ小鼠杂交以获得后代。我们使用来自脚趾的基因组DNA,通过PCR和Sanger测序对小鼠进行基因分型。 用于扩增和测序的PCR引物在表2中显示。
表1. 小鼠基因组中单向导RNA(sgRNA)的靶序列。
Location of target region
Sequences (5’-3’)
Exon 2 of Tbx6
GAGGCCCTTCACTCGCTTCC
Conserved regulatory region in the Tbx6promoter
CCTAGGGATCAATCAGACCGAGG
Note: Sequences of sgRNA targets are underlined and the protospacer adjacent motif (PAM)sequences are shown in red.
表2. 小鼠Tbx6基因分型的引物。
Primer
Sequence
Tbx6mh-F
5'-CAAGCGTCAGAGAAGACCACCA-3'
Tbx6mh-R
5'-CCTTACCCAGAGCCAATCCAAC-3'
Tbx6-exon 2-F
5'-ATCCTCATTCTTCCCACATCTC-3'
Tbx6-exon 2-R
5'-ATGCCCACCTCTTACAGTTTCT-3
1. 剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型
使用小鼠胚胎的体内测定,我们展示了剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型。该模型由Tbx6无效等位基因 (‒)和亚等位基因(mh)组成。(A)阿尔新蓝染色的E14.5小鼠胚胎的背面视图。显示了一个没有明显椎体畸形的胚胎。(B)显示了一个具有椎体畸形的胚胎。红点和箭头分别表示椎体畸形和肋骨融合。比例尺为1mm。(C)在Tbx6 + / +,Tbx6 + / mh,Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ‒ 的E14.5小鼠胚胎中未观察到明显的椎体畸形,而Tbx6 mh / ‒ 胚胎表现出高穿透率的椎体畸形。样本量显示在下面的列中。****,P <0.0001。
2.成年小鼠的Micro-CT结果
成年小鼠的Micro-CT结果。(A)通过Micro-CT扫描显示成年小鼠的背侧和腹侧图像,未见明显椎体畸形。(B)通过Micro-CT扫描显示一只具有椎体畸形的小鼠。白色箭头和箭头分别指示椎体畸形和肋骨融合。(C)Tbx6 + / +,Tbx6 + / mh,Tbx6 mh / mh,Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ‒ 基因型的成年小鼠Micro-CT图像。样本量显示在每列下方。 ****,P <0.0001。
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