博来霉素多次染毒诱导C57BL/6J小鼠肺纤维化模型

利用C57BL/6J小鼠制备肺纤维化模型。

3.1实验动物
C57BL/6J小鼠45 只（SPF 级），体重20--22g，10-12周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［动物合格证：SCXK（京）2015-0035］，饲养和实验在中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境内进行，温度为20-26℃，相对湿度50%-60%。

3.2试剂
博来霉素（BLM）：注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社；盐酸氯胺酮注射液：沈阳市兽药厂，兽药字（2011）060022668；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒：碧云天；核固红染色液（0.5%）：北京雷根生物技术有限公司。

3.3模型建立
14周龄的雄性小鼠按体重随机分为未处理组（n=5）和处理组（n=40），处理组气管滴注BLM溶液（0.4mg/ ml，每只100ul），未处理组小鼠不经任何处理，处理组小鼠用注射用盐酸氯胺酮150mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露声门，用接套管的1ml注射器气道给药。两星期给药一次，给药8次，第一次给药为0周，在0.5个月、1个月、2个月、4个月时分别取肺组织，称重，取右肺中叶做冰冻切片，剩余肺组织10%中性甲醛中固定制备石蜡切片做HE染色、Masson染色。

3.4 HE染色
肺组织10%中性甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋后，切片5um，进行苏木素—伊红染色，普通光学显微镜（BX50，Olympus, Japan）下观察肺组织病理学改变，病理学镜检人员进行单盲评分。

3.5 Masson染色
肺组织石蜡切片脱蜡，蒸馏水冲洗，Masson染色复合液染色5min，自来水冲洗，0.2%醋酸浸洗，自来水冲洗，1%磷钨酸，水洗后亮绿染色液染色15min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻，脱水、透明、固封。

3.6 肺系数
小鼠在BLM处理0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取肺组织，称重，计算肺系数。肺系数=肺组织重量（mg）/小鼠体重（g）。

3.7 冰冻切片
小鼠在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取右肺中叶，速冻后，将肺组织浸没在适量的包埋剂中，用冰冻组织切片机制作8um的切片。

3.8 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法
肺组织冰冻切片按试剂盒说明操作。先用试剂盒中固定液固定15min，PBS洗3次，每次3min，配置染色液，滴加到冰冻切片上，37℃培养箱（无CO2）过夜后，PBS洗一遍，核固红（0.5%）复染15min，使细胞核变为红色，便于区分细胞。

3.9 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，结果以均数±标准差（±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

4.1博来霉素多次给药对小鼠体重的影响

雄性C57BL/6J小鼠随机分为未处理组和处理组，处理组第1次染毒为0周，未处理组和处理组每周称重一次。

图1：博来霉素对小鼠体重的影响

结果发现：未处理组小鼠体重呈逐渐上升趋势。与未处理组小鼠比较，BLM第一次给药（0周）后，处理组小鼠体重下降趋势，但无显著性差异（P>0.05），在1周后逐渐回升；在第5周时与未处理组小鼠体重未见明显差异，随后体重与未处理组体重增长趋势一致；在14周时体重超过未处理组，15周、16周、17周体重均高于未处理组，无显著性差异（P>0.05）（图1）。

4.2博来霉素多次给药过程中肺系数的变化

小鼠在染毒0.5个月、1个月、2个月、4个月四个不同时间点取材，分离肺组织，称重，计算肺系数。

图2：BLM处理不同时间点的肺系数

注：*与未处理组相比，P<0.05。

处理组小鼠0.5个月、1个月、2个月、4个月的肺系数均高于未处理组，与未处理组比较，1个月、2个月、4个月无显著性差异（P>0.05），2周时肺系显著高于未处理组（P<0.05）；且0.5个月时高于1个月、2个月、4个月的肺系数，但无显著性差异（P>0.05）（图2）。

4.3 博来霉素多次给药肺组织病理学改变

根据HE染色结果，对肺组织病理学评分：由一个0—12 分范围组成，每张切片，3 个分类评价指标【12】：肺泡间隔增宽、肺泡腔内纤维化渗出的严重度、血管周围炎细胞浸润的程度，每种分类又分为：0 分为正常；1 分为轻度；2 分中度；3分重度；4 分极重度。合并后记分。

图3：肺组织HE染色（×100）

注：A 未处理组，B 0.5个月，C 1个月，D 2个月，E 4个月

图3显示，BLM给药过程中，在BLM第一次给药后0.5个月、1个月、2个月、4个月这四个时间点，肺组织肺泡腔胞浆渗出逐渐减少、炎细胞浸润依次减弱、肺泡间隔差异不明显。

从总分来看，在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点中0.5个月时分数最高，与未处理组相比，0.5个月、1个月、4个月评分具有显著性差异（P<0.05）。从单项评分来看，1）肺泡间隔增宽：四个时间点中0.5个月时分数较高，1个月、2个月、4个月评分相对稳定，与未处理组相比，0.5个月、2个月、4个月评分具有显著性差异（P<0.05）；2）肺泡腔内渗出：0.5个月时分数高于其他三个时间点，与未处理组相比，0.5个月、4个月具有显著性差异（P<0.01）；3）血管周围炎细胞浸润：四个时间点中0.5个月时分数最高，与未处理组相比具有显著性差异（P<0.01），1个月、2个月、4个月评分呈逐渐递减的趋势，4个月时与未处理组炎细胞浸润水平接近。

表1：不同时间点肺组织的病理评分（±S, n=5）

注：*与未处理组相比，P<0.05；**与未处理组相比，P<0.01。

4.4 博来霉素多次给药肺组织胶原沉积的变化

图4：肺组织Masson染色（×100）

注：A 未处理组，B 0.5个月，C 1个月，D 2个月，E 4个月

与未处理组比较，0.5个月时已出现蓝绿色的胶原纤维，1个月、2个月、4个月胶原纤维持续存在（图4）。

4.5博来霉素多次给药对肺组织衰老细胞的影响

未处理组和BLM给药4个月的肺组织冰冻切片进行SA β-gal染色，衰老细胞的胞浆为蓝色。

图5：SA β-gal染色（×100）

注：A 未处理组，B 4个月

SA β-gal染色结果显示，在染毒四个月时的冰冻切片，蓝色细胞明显比未处理组多，说明小鼠肺组织中出现较多衰老细胞（图5）。