A/Anhui/1/2013(H7N9)滴鼻途径感染BALB/c小鼠模型

2023-12-21 15:15:12

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摘要：2013 年3 月31 日，依据《国际卫生条例（2005）》，中国政府报告上海和安徽发现3 例人感染新型甲型H7N9 禽流感病毒（以下简称H7N9）病例。在随后的几个月内，以华东地区为代表的我国多个省市陆续确诊并报道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的病例，这是世界首次发现的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情，引起了全球广泛关注。

H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因，N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 个内部基因片段重配而成的新型病毒。对目前已公布了全基因组的
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资源中文名称

A/Anhui/1/2013(H7N9)滴鼻途径感染BALB/c小鼠模型

资源英文名称

A/Anhui/1/2013(H7N9) virus intranasally infected BALB/c murine model

疾病概述

2013 年3 月31 日，依据《国际卫生条例（2005）》，中国政府报告上海和安徽发现3 例人感染新型甲型H7N9 禽流感病毒（以下简称H7N9）病例。在随后的几个月内，以华东地区为代表的我国多个省市陆续确诊并报道多例H7N9禽流感病毒感染人造成重症肺炎甚至死亡的病例，这是世界首次发现的新型重配H7N9禽流感病毒所致的人感染疫情，引起了全球广泛关注。 H7N9禽流感病毒是由H7 的HA 基因，N9 的NA 基因以及H9N2 病毒的6 个内部基因片段重配而成的新型病毒。对目前已公布了全基因组的若干H7N9禽流感患者分离株的序列分析结果显示，该病毒具有与之前其他亚型甲型流感病毒类似的遗传特征，包括对禽类低致病性，感染哺乳动物的能力增强，对金刚烷胺类抗病毒药物耐药，以及对神经氨酸酶抑制剂（如奥司他韦和扎那米韦）敏感。

实验动物背景信息

小鼠由于繁殖周期短、遗传背景均一、个体差异小等优点，被广泛用作流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。小鼠多表达禽源流感病毒α2,3SA受体，人源流感病毒α2,6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α2,3SA受体结合的流感病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

制作流感病毒感染动物模型多应用SPF级雌性BALB/c小鼠，4-6周龄。

模型制作方法

病毒株为A/Anhui/1/2013 (H7N9)，BALB/c小鼠经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒。小鼠感染后观察14天，监测存活率及体重变化率。感染后分时间段安乐小鼠，每个时间点收集相同数量小鼠肺、脾、脑、心等组织，进行病毒滴度测定和组织病理学检查。

模型表型数据

小鼠感染H7N9病毒后的存活情况如图1A所示，其中接种106TCID50病毒的小鼠14天内全部存活，而107或108TCID50病毒对小鼠的致死率分别达20%和60%。小鼠感染106TCID50病毒后，第2天开始出现体重下降的现象，第9天体重降至最低，仅为攻毒前的71.1%，随后体重便逐渐上升直至完全恢复（图1B及表1）。此外，部分小鼠感染后第3天开始出现竖毛现象，第4天时所有小鼠均出现并持续至感染后第14天（图2及表1）。

图1 BALB/c小鼠感染H7N9病毒后的存活率及体重变化情况。(A)小鼠分别感染108, 107, 或106TCID50的H7N9病毒后的存活率。(B) 小鼠感染106TCID50的H7N9病毒后的体重下降情况。

图2 BALB/c小鼠感染H7N9病毒后的临床症状

表1 BALB/c小鼠感染106TCID50的H7N9病毒后的临床表现

感染后天数	临床表现
感染后天数	体重下降#	竖毛#	死亡#
1	3/10	0/10	0/10 (0%)
2	8/10	0/10	0/10 (0%)
3	9/10	7/10	0/10 (0%)
5	8/10	10/10	0/10 (0%)
7	8/10	10/10	0/10 (0%)

#出现该临床表现的动物数量占总观察数量的比例。

1.小鼠模型感染后病毒在组织中复制情况

接种106TCID50病毒的小鼠在感染后1，2，3，5，7天各安乐解剖6只，来分析病毒的组织分布。从感染后第1天至第7天，小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织均可检测到排毒，其中BALF排毒的峰值出现在感染后第1天（103.75TCID50/ml），而肺组织的排毒峰值出现在感染后第2天（105.69TCID50/g）（图3及表2）。除呼吸道外，病毒还可从小鼠的脑、肝、脾、肾、和小肠中检出（表2）。

图3 BALB/c小鼠感染H7N9病毒后的支气管肺泡灌洗液（BALF）及肺组织携带的病毒滴度。* P<0.05.

表2 BALB/c小鼠感染106TCID50的H7N9病毒后各组织病毒复制情况

		病毒滴度 (Log10TCID50/g)
BALF	肺		脑	心	肝	脾	肾	小肠
3.75 (4/6)#	4.15 (4/6)		-	-	-	-	-	-
2.31 (5/6)	5.69 (5/6)		-	-	-	1.25 (2/6)	1.88 (4/6)	-
2.75 (6/6)	4.38 (6/6)		-	-	-	-	-	0.69 (5/6)
3.58 (6/6)	5.38 (6/6)		-	-	0.58 (2/6)	-	-	-
2.31 (6/6)	3.69 (6/6)		-	-	-	-	-	-

#病毒检测阳性的动物数量占总解剖动物数量的比例。

2.小鼠模型感染后组织病理损伤

免疫组织化学（IHC）检测发现病毒抗原主要分布于肺支气管上皮细胞、脑脉络丛、小肠绒毛柱形细胞、以及肾小管内（图4 (i-iv)）。H-E染色结果证实从感染后第1天起，肺组织即呈现出典型的流感病毒感染的病理表现，包括炎性充血和渗出性病理改变等等。感染后3-7天，肺组织病变面积进一步扩大，并发展为重度间质性肺炎（图4 (v-viii)）。

图4 BALB/c小鼠感染H7N9病毒后的各组织切片H-E染色和免疫组化分析。

4. 小鼠模型感染后血清特异性抗体产生情况

感染后第14天，对存活小鼠的眼眶静脉丛血清进行血凝抑制实验（HI），测定对H7N9病毒的特异性抗体效价，结果证实所有小鼠均出现抗血清转阳，对H7N9病毒的HI效价达80-160。

5. 小鼠模型感染后血常规检测结果

临床研究证实，患者感染H7N9病毒后，会出现显著的白血球减少症。在小鼠模型中，我们同样观察到这一现象。与小鼠感染前相比，接种H7N9病毒后第2-7天，小鼠的白细胞总数出现了显著下降（P<0.05）。感染后第2天，还可见显著降低的淋巴细胞和显著升高的中性粒细胞（P<0.05）（表3）。

表3. BALB/c小鼠感染H7N9病毒后均出现白血球减少症。

感染后天数	WBCa	% LYb	% NEb
-1c	12.0	78.4	12.5
1	11.4	64.4	23.3
2	6.9*	48.7*	43.8*
3	5.5*	62.5	27.1
5	6.8*	77.1	15.7
7	5.3*	64.6	21.5

a白细胞总数，表示为每微升外周血中103白细胞数量。

bLY；淋巴细胞，NE：中性粒细胞，数值为6只小鼠的平均值。

c-1天：感染H7N9前一天基础数值。

* 相较-1天结果，P<0.05。

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