非小细胞肺腺癌NCIH1299绿色荧光标记细胞BALB/c裸小鼠肿瘤模型

H1299非小细胞肺腺癌细胞，又称为NCI-H1299或CRL-5803，是一种非小细胞肺癌细胞株，来源于肺癌的淋巴结转移灶，在生物研究中有着广泛的应用。与其他永生细胞系不同，H1299细胞系不能被明确的鉴定区分。该细胞纯合缺失TP53基因，从而导致该细胞系不具有肿瘤抑制因子p53蛋白的表达，而p53恰恰被认为是肿瘤细胞无限增殖潜能的表现。报道称，NCI-H1299细胞系表达并分泌神经调节肽B（NMB）而非胃泌素释放肽（GRP）。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/c-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/c-nu/+）。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，每窝平均成活3.62只仔鼠，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB/cA-nu小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养：NCI-H1299肺癌细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

4.3细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染NCI-H1299细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的NCI-H1299细胞系（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

图3 皮下接种H1299-eGFP肿瘤生长影像分析

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第4周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大（图3）。