滴鼻感染MERSCoV小鼠模型

MERS感染的恒河猴、狨猴动物模型成本较高、操作复杂，制约其在实验中大规模使用。建立一个经济实用的小动物模型作为灵长类模型的有益补充非常必要。BALB/c小鼠由于其良好的性能（遗传背景均一、个体差异小等优点）已被广泛应用于科学研究。然而BALB/c小鼠缺乏MERS-CoV的受体DPP4( 亦称CD26)，自然情况下是不能被感染的。

利用不同剂量DPP4转导SPF级雌性BALB /c小鼠后建立MERS-CoV感染的动物模型。

MERS-CoV (hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷兰伊拉斯姆斯大学生物中心Ron Fouchier 教授馈赠。Ad5-DPP4 由美国爱荷华大学微生物与儿科学教研室赵金存教授馈赠。

DPP4 转导组小鼠在MERS-CoV 攻毒前，滴鼻转导Ad5-DPP4。高剂量DPP4 转导组转导剂量为2.5×108PFU/50μl/只，低剂量DPP4 转导组转导剂量为0.5×108PFU/50μl/只，PBS 对照组鼻腔滴入50μl PBS。DPP4 转导处理后5 天，进行MERS-CoV 滴鼻攻毒，攻毒剂量为5×105TCID50/50μl/只。观测临床症状和死亡情况。动物安乐死后，取肺组织制备病理标本，进行HE染色和免疫组化染色。剩余3只进行肺灌洗，用于病毒滴度和病毒载量测定。感染后14天，取血，分离血清用于IgG抗体和中和抗体检测。

1、不同剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠体征

MERS-CoV攻毒后，各组小鼠均无死亡。但DPP4转导组小鼠均出现了明显的感染症状，主要表现为精神不振、弓背、蜷缩、竖毛、活动少、扎堆等（图1A）。高剂量DPP4转导组小鼠较低剂量DPP4转导组小鼠症状更为明显，持续时间也较长。PBS对照组小鼠无任何临床症状。攻毒后DPP4转导组小鼠均出现明显的体重下降，高剂量DPP4转导组小鼠体重下降更为明显。高剂量DPP4转导组小鼠攻毒5d后体重开始恢复，而低剂量DPP4转导组小鼠攻毒3d后体重开始恢复。而对照组小鼠体重变化不明显（图1B）。

图1 小鼠MERS-CoV攻毒后临床症状

（A：表型观察；B：MERS-CoV攻毒后体重变化）

2、不同剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠的病理学检查

MERS-CoV感染后3d，大体解剖可见两种剂量DPP4转导组小鼠肺部均有不同程度充血呈暗红色，而对照组小鼠肺部无明显变化（图2）。且高剂量DPP4转导组小鼠肺部病变面积明显大于低剂量DPP4转导组小鼠。显微病理检查可见DPP4转导组小鼠均发生间质性肺炎，表现为肺泡隔中度到重度增宽，肺组织中可见少量到多量炎性细胞浸润和浆液性渗出，炎细胞以巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞为主。而对照组小鼠无此变化（图3A）。免疫组化分析表明DPP4转导组小鼠肺组织中可检测到病毒蛋白的表达，阳性细胞主要分布在肺组织的支气管上皮细胞中。对照组小鼠肺中并未检测到病毒特异蛋白的存在（图3B）。

图2 小鼠肺大体解剖图（三角：正常肺组织；箭头：肺部充血）

图3 小鼠肺病理变化（A）与免疫组化染色（B）

3、不同剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠肺组织病毒载量

MERS-CoV攻毒后3天，每组安乐死3只小鼠，取肺组织灌洗液进行病毒滴度和载量测定。DPP4转导组小鼠，肺部均检测到较高的病毒载量，但低剂量和高剂量DPP4转导组小鼠差异不显著（P>0.05）。PBS对照组小鼠肺部检测不到病毒核酸的存在。将肺部灌洗液接种Vero细胞进行病毒分离，发现DPP4转导组小鼠肺部均能分离到MERS-CoV，并且高剂量DPP4转导组小鼠肺部病毒滴度最高。PBS对照组小鼠则分离不到病毒(图4)。

图4、小鼠肺组织病毒核酸载量检测（A）与病毒滴度测定（B）

4、不同剂量DPP4转导后MERS-CoV感染小鼠血清IgG抗体和中和抗体

图5 MERS-CoV感染小鼠模型的血清抗体应答检测

（A：抗原特异性IgG抗体；B：血清中和抗体）