APPswe转基因阿尔兹海默病小鼠模型

APP基因位于染色体21q11.2-22.2上，由18个外显子和17个内含子组成。基因产物为跨膜糖蛋白，由APP基因通过选择性剪切翻译而成。APP至少有六种剪接形式，长度分别为365、563、695、714、751、770个氨基酸残基，其中695、751和770为主要形式。APP695主要在大脑表达，尤其在AD病人的海马回和皮层中APP695与APP751的比率异常，且与脑中这些部位斑块的数量呈正相关。由APP编码的APP蛋白经过加工水解可产生β淀粉样蛋白（β amyloid， Aβ）。病理情况下，APP经过β分泌酶和γ分泌酶分解生成Aβ40和Aβ42，其中Aβ42与AD患者脑中Aβ沉积和神经元的变性密切相关。在家族性AD患者中已鉴定出多个APP基因的突变位点。其中大部分突变位于外显子16和17的分泌酶裂解位点或APP跨膜区，如APP瑞典突变（APPswe：APP K670N和M671L）和伦敦突变（APPlon：APPV717I）。APP突变可改变APP的加工过程，导致具有神经毒性作用的Aβ42产生，引发多种病理机制，促使神经细胞凋亡或死亡，最终导致AD的发生。

构建带有神经特异性启动子的质粒PrP-hAPP695K595N/M596L，用显微注射法将线性化转基因质粒注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，以C57BL/6J小鼠作假孕受体

2、基因型鉴定

提取首建鼠后代鼠尾DNA，PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。

图1. PCR鉴定APPswe转基因小鼠的凝胶电泳分析结果。

1-2：阴性小鼠；3-8：APPswe转基因阳性小鼠；9：Marker；10：阳性对照

3、APP蛋白在APPswe转基因小鼠脑中的表达鉴定

免疫组化：

抗人APP抗体免疫组化染色显示转基因小鼠大脑皮层和海马神经元胞质阳性染色，神经胶质细胞及细胞间质未见阳性着色。阴性对照组小鼠皮层和海马神经元胞质染色阴性。

图2、抗人APP抗体免疫组化染色结果。

4、APPswe转基因小鼠脑部病理表型

Aβ免疫组化染色：

Aβ1-16免疫组化染色显示大脑皮层神经元细胞以锥体细胞为主胞质呈明显阳性着色，神经胶质细胞及间质未见阳性着色。对照组大脑皮层细胞及间质均染色阴性。Aβ1-42免疫组化染色显示大脑皮层神经元细胞以锥体细胞为主胞质呈阳性着色，间质内亦可见散布分布不均的阳性着色颗粒。对照组大脑皮层细胞及间质均呈阴性着色。

图3、APPswe转基因小鼠大脑Aβ免疫组化染色结果

a、APPswe转基因小鼠大脑皮层Aβ1-16免疫组化染色（400╳）；b、APPswe转基因小鼠大脑皮层Aβ1-42免疫组化染色（400╳）；a、阴性对照小鼠免疫组化染色（400╳）

5、APPswe转基因小鼠行为学表现

水迷宫实验

Morris水迷宫实验结果显示随着月龄的增加，转基因小鼠在水迷宫实验中错误次数及寻找平台的潜伏期逐渐增加，且差异逐渐明显，表明随着增龄，转基因小鼠学习记忆能力下降。

跳台实验

将动物放在实验仪器内适应环境3min，然后底部栅板通上36V交流电，记录小鼠5min内跳下跳台的次数，作为学习测试。24h后重复实验，记录小鼠从放到绝缘跳台上到第1次跳下高台受到电击的时间及跳下跳台的次数，作为记忆测试。实验结果显示转基因小鼠随月龄增加，学习次数呈增加的变化，12月龄时与6月龄相比有明显差异，提示转基因小鼠学习记忆能力随年龄逐渐下降。