CD4+T细胞GPR68基因敲除黑色素瘤小鼠皮下移植瘤模型

C57BL/6J小鼠

（一）构建GPR68-FloxP小鼠

1、实验设计

GPR68只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将FloxP基因插入GPR68基因两端。

图2 插入位点设计

2、Cas9/gRNA的活性检测

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测内源活性。根据Cas9/gRNA的内源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。

3、构建同源重组模板（Donor质粒）

根据靶点的位置设计并构建Donor DNA。

4、基因敲除小鼠的建立和和品系交配GPR68-FloxP小鼠的构建

将Cas9nickase、 GPR68-L1和GPR68-R1体外转录成mRNA和RNA后，加上Donor DNA显微注射到小鼠的受精卵中，以高效获得基因敲入的小鼠。采用直接注射受精卵实现基因敲除，由于在受精卵发育早期，甚至单细胞时期就发生基因敲入，因此小鼠嵌合率高，小鼠传种的几率比囊胚注射ES Cell高。

小鼠出生2周后，剪鼠尾，提取基因组DNA进行PCR加上测序检测小鼠基因型，测序检测是否实现了两个位点的FloxP精确插入。

5、CD4+T细胞特异性敲除GPR68小鼠的构建

图3 GPR68-FloxP小鼠与CD4-Cre小鼠杂交

将GPR68-Flox/Flox小鼠与CD4-Cre小鼠杂交，子代小鼠即为CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的构建

1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。

2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。

3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。

4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。

5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量。

在无特殊刺激的情况下，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠组织中GPR68表达，如图4所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。

图4鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达

a.鼠尾DNA水平的鉴定；b. mRNA水平鉴定；c.蛋白水平鉴定

分别对WT与CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠进行皮下注射接种5×105个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量体积等。如图5所示，与WT小鼠比较，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠能够明显抑制黑色素瘤的生长。

图5CD4+ T 细胞GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用