重症登革热小鼠模型

小鼠模型是登革病毒感染及登革热发病机制研究的重要工具。科研人员最初使用登革病毒临床分离株颅内感染正常小鼠，感染效果差，且出现麻痹等神经症状，不适合建立动物模型。之后，鉴于干扰素的抗登革病毒作用，研究者利用缺乏IFN-ɑ/β、IFN-γ受体的AG129小鼠构建登革病毒感染模型，但存在一定程度的免疫抑制，限制了该模型的应用。然后，为建立免疫完整性更高的小鼠模型，使用交替传代病毒株感染I型干扰素受体敲除小鼠（Ifnar1-/-）建立小鼠模型。这些模型都未能很好的展现血浆渗透、血小板降低、肝肾损害等重症登革热的典型表现。基于此，本研究拟通过小鼠体内传代，获得登革病毒小鼠适应株，感染Ifnar1-/-小鼠建立重症登革热小鼠模型。

1. 小鼠感染：使用1ml胰岛素注射器分别吸取100 μL病毒液（8×106 Copies/μL），尾静脉接种4-6周Ifnar1-/-小鼠。每日进行称重，观察小鼠临床表现。发病率评分基于Orozco等人描述的1至5的等级：1. 健康；2.轻度嗜睡；3.嗜睡、竖毛、弓背；4.嗜睡、竖毛、弓背、虚弱；5.垂死。感染后第2、4、6、8天动物眼眶采血，用于血常规检查；分离并冻存血清，用于病毒载量测定；血浆用于细胞因子测定；分批安乐小鼠，采取肠、脾脏、肾脏、肝脏、脑等器官，用于病毒载量检测及组织病理学观察。

2. 病毒载量检测：使用实时荧光定量PCR方法检测小鼠血清和组织中的病毒核酸。简单的，配置反应体系，上下游引物及探针序列分别为DENV-F: 5’-GAR AGA CCA GAG ATC CTG CTG TCT-3’，DENV-R: 5’-ACC ATT CCA TTT TCT GGC GTT-3’,Probe: (FAM)AGC ATC ATT CCA GGC AC(MGB)。Real-time PCR反应条件为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 15s；60℃ 60s，40个循环。

3. 全血细胞计数：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，使用爱德士ProCyte Dx* 全自动血细胞分析仪对样本进行血细胞分析。方法如下：首先输入样本编号，选择小鼠物种、类别和模式；其次准备样本：轻轻倒转样本10次，确保其混合均匀；最后将装有样本的采血管放入适配器；然后开始分析。主要分析：红细胞计数（RBC）、红细胞比容（HCT）、血小板计数（PLT）、中性粒细胞计数（NEUT）、淋巴细胞计数（LYMPH）。

4. 组织病理学观察：安乐小鼠，解剖采集肠、脾脏、肝脏、肾脏、脑组织，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。

5. 细胞因子分析：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，分离血浆，进行细胞因子检测。方法简述：1）稀释试剂；2）溶解标准品并对倍稀释；3）准备微球，与样本共同孵育；4）洗板；5）加入检测抗体；6）再次洗板；7）加入SA-PE ；8）洗板；9）上机检测；10）结果分析。

1.Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的临床表现

为确定NGC株与N10株对小鼠致病性的差别，分别使用NGC株与N10株感染4~6周Ifnar1-/-小鼠，监测小鼠体重变化、疾病症状、致死情况等临床表现。结果显示：两株病毒感染小鼠的体重都在Dpi.2开始下降，Dpi.8 NGC感染组小鼠体重为原始体重的98.8%，而N10感染组小鼠体重为原始体重的79.2%（见图1A）。疾病症状方面，NGC感染组小鼠在Dpi.7出现侧瘫等神经症状；N10株感染小鼠在Dpi.4产生竖毛、虚弱等表现，Dpi.5产生弓背，Dpi.8发生死亡（见图1B、1C），两组具有统计学差异（P<0.01）。结果表明：与NGC株感染小鼠相比，N10株感染小鼠体重下降幅度较大，疾病症状明显，死亡率较高，提示N10株对小鼠的致病性高于NGC株。

图1 DENV感染小鼠体重变化情况及临床表现

Figure 1 Body weight changes and clinical manifestations of DENV-infected mice

2. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的病毒载量

为确定NGC株与N10株在小鼠体内复制水平的差异，在小鼠分别感染两株DENV后第2、4、6天收集组织（肠、脾脏、肝脏、肾、脑）和血清样本，使用实时荧光定量PCR方法进行病毒载量的检测。结果显示：小鼠血清中，N10感染组在Dpi.6仍可检测到病毒载量，且显著高于NGC株（见图2A）。与其他组织比较，小鼠脾脏中病毒核酸拷贝水平较高，在Dpi.2两组小鼠脾组织病毒载量差异具有统计学意义(见图2B)。在肾脏和肠组织中，NGC株感染的小鼠仅在Dpi.4检测到病毒载量，而N10株感染的小鼠均可检测到病毒载量(见图2C和2D)。在肝脏中，NGC感染的小鼠并未检测到病毒核酸，而N10株感染小鼠在Dpi.2和Dpi.4均检测到病毒核酸，且在Dpi.4有较高的病毒核酸拷贝数（见图2E）。脑组织中，N10株感染小鼠病毒核酸水平高于NGC株感染小鼠。表明N10株在小鼠体内的分布范围明显高于NGC株，维持时间也明显高于NGC株，说明其更能适应小鼠机体。

图2 DENV感染小鼠病毒载量水平

Figure 2 Viral load levelsof DENV-infected mice

3. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的血常规情况

血小板下降和白细胞下降是人类感染登革热的标志性特征之一，为确定NGC株与N10株对小鼠体内血小板和白细胞水平影响的差异，使用血细胞分析仪进行血常规检查。结果显示：在Dpi.2，与NGC组小鼠相比，N10组小鼠的血小板、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数均显著降低，具有统计学意义（见图3A-D）。而血细胞比容未见明显差异(见图3E)。N10组小鼠在Dpi.2，红细胞水平高于NGC组。与NGC株感染小鼠相比，N10株感染的小鼠，血小板、白细胞下降水平更显著，说明N10株比NGC株对Ifnar1-/-小鼠的致病力强。

图3 DENV感染小鼠血细胞计数

Figure 3 Complete blood count of DENV-infected mice

4. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的病理学变化

为比较两株DENV对Ifnar1-/-小鼠病理表现的差异，大体解剖发现，肝组织表面有大量坏死灶。将小鼠组织用10%福尔马林固定，苏木精伊红染色(HE染色)，进行详细分析。首先，与正常未感染小鼠相比，NGC组所有小鼠脑组织切片在Dpi.6开始观察到脑干、小脑出血、炎性细胞浸润等病理表现。仅有25%的N10组小鼠在Dpi.6出现脑干出血、大脑脑膜血管扩张充血，炎细胞浸润等病理表现。表明N10株相对于NGC株对小鼠的神经毒力下降。其次，在Dpi.6，两组小鼠肾脏中均产生肾小管上皮细胞水肿、空泡变性的病理表现。两组小鼠肠组织内均未见明显病理变化。脾脏组织中，Dpi.2，NGC组小鼠未见明显病理变化，N10组小鼠脾脏有出血，灶性坏死的病理表现。Dpi.4，两组小鼠均有红髓细胞增生的病理表现。Dpi.6，NGC组小鼠髓外造血，N10组小鼠脾脏结构不清晰，红髓大量细胞增生（见图4B）。肝脏组织中，Dpi.2，NGC组小鼠有轻度肝细胞水肿；N10组小鼠表现为灶性凝固性坏死。Dpi.4，NGC组小鼠肝细胞灶性凝固性坏死伴有炎细胞浸润，N10组小鼠产生肝细胞空泡变性和灶性坏死的病理表现。Dpi.6，NGC组小鼠表现为空泡变性，小灶性炎细胞浸润。N10组小鼠表现为灶性坏死和炎细胞浸润(见图4A)。表明：N10株感染小鼠后，病理表现发生了变化，与人类重症登革病理表现趋同。

图4 DENV感染小鼠组织病理学变化

Figure 4 Histopathological changes in DENV-infected mice

注：以上均为HE染色结果（100X）

5. Ifnar1-/-小鼠感染DENV后的细胞因子

在重症登革患者观察到细胞因子水平的改变。为比较NGC株与N10株DENV对小鼠细胞因子表达的影响，收集DENV感染后的小鼠血浆，通过Luminex检测多种细胞因子。结果发现，N10组小鼠血浆内的IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α等炎症因子水平在Dpi.2显著高于NGC组。Dpi.4，N10组TNF-α急剧增加，高于NGC组，表明Th1细胞介导的炎症反应增强。据报道IL-6和TNF-α水平升高与重症登革相关，因此N10株感染小鼠模型疾病严重程度增加。在Dpi.2，N10组的 IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-22水平均高于NGC组。在感染后的前四天，IL-13、IL-18、IL-22等细胞因子水平逐渐升高。但N10组的IL-2水平低于NGC组。由于Th2细胞分泌的IL-5、IL-6、IL-13等因子主要参与B细胞增殖、分化和抗体产生，因而IL13等因子水平增加，提示与疾病严重程度相关。趋化因子：MIP-α、RANTES、MCP-3等细胞因子水平在感染前四天也呈上升趋势，N10组的表达量高于NGC组。表明：IL-6、IFN-γ、IL-13、IL-22等细胞因子水平升高，可能介导重症登革热的产生。

图5 DENV感染小鼠细胞因子表达水平

Figure 5 Cytokine expression levels in DENV-infected mice