H7N9禽流感病毒感染小鼠模型

BALB/c为近交系小鼠，遗传背景一致，微生物背景可控，个体间相似度高，易于操作；小鼠相关的免疫球蛋白、细胞类型、细胞因子等试剂己商品化，费用和饲养要求低。此外，H7N9病毒直接感染的BALB/c小鼠，感染模型主要表现为下呼吸道感染，重症肺炎，肺部病理学损伤类似人感染后的严重病例，甚至导致小鼠死亡。所以BALB/c小鼠可作为研究流感病毒致病性、传播力及传播机制的主要动物模型之一。

1. 实验环境

生物安全实验室3级：参照2013年4月2日卫计委专家对新发甲型H7N9禽流感病毒生物安全评估会议指南暂定H7N9禽流感病毒属于二类。将H7N9禽流感生物危害等级定位Ⅲ级。已被我国列为按甲类传染病管理的乙类传染病，对其病原体和动物感染实验的操作应该在ABSL-3实验室中进行。

独立通风笼（IVC）

2. 实验材料

1）毒株：H7N9毒株（A/Anhui/1/2013）；

2）实验动物：SPF 雌性4-6周龄BALB/c小鼠；

3）试剂：DMED培养液，RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74106）等

4）实验仪器：

微型离心机（EASTWIN6000）

高速冷冻离心机(KUBOTA3500)

电动研磨器(德国IKA-T10)

倒置显微镜(Nikon)

实时荧光定量检测系统（ABI）

二氧化碳培养箱（Thermo371）

生物安全柜

3. 实验操作规程
1）动物分组：H7N9流感病毒感染20只4-6周龄BALB/c雌性小鼠，其中10只为临床观察组，另外10只用于检测病毒的组织分布，为解剖组（5只于感染后3天安乐并解剖，5只于感染后5天安乐并解剖）。
2）病毒接种：动物适应后使用三溴乙醇以0.02mL/g比例进行肌肉注射麻醉。麻醉后每只小鼠滴鼻接种0.05mL病毒效价为105TCID50/mL的病毒稀释液。
3）临床指标：对临床观察组（n=10）小鼠进行持续21天的观察，感染后0-14天每天记录体重和死亡率，观察动物的一般状况，包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况，体重下降率超过25%为人道终点实行安乐。
4）病毒的组织分布：解剖组小鼠（n=10）感染后3天和5天各解剖5只（n=5），取脑、气管、肺、肾、眼拭子进行病毒滴度测定。
5）病毒分离：感染后第3、5天感染雪貂安乐处死，尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织，研磨处理后，接种MDCK细胞。每天观察病变，持续观察3d，用火鸡红细胞测定HA确认。HA方法具体为：将接种标本的MDCK上清液取出50uL，加入等体积火鸡红细胞，室温反应30min，出现凝集反应，结果为阳性。
6）H7N9病毒RNA的检测：感染后第3、5天感染雪貂安乐处死，尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织，研磨处理后，操作步骤：将100uL组织研磨液上清移入裂解液（Qiagen）中，放入buffer RLT（已加入1%巯基乙醇）350uL，4℃，13000rpm离心3min，将上清转移至新1.5mL微量离心管中，提取组织研磨液核酸。使用RNA一步法试剂盒，通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。
7）H7N9病毒抗体检测：动物感染后不同时间点采血分离血清，-80℃下保存备用。血清H7N9病毒性抗体检测（HI方法）具体操作步骤为：每孔加入1:10~1:1280稀释的待检血清，加入8HA的病毒，室温孵育30min。此后检测凝集结果，血清凝集的效价为该血清可中和的抗体的效价。
8）病理学研究：大体观察，处死动物后，详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化；病理切片准备，取处死动物的肺等组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE或免疫组织化学染色后，镜检观察。

小鼠感染H7N9模型指标和结果

BALB/c小鼠攻毒后第1天开始活动减少、拒食、竖毛等现象出现。3d开始出现死亡。RT-PCR检测结果显示肺组织中存在大量H7N9病毒；病毒分离结果显示小鼠病毒在小鼠体内的复制高峰期时第2~6天。解剖可观察道小鼠肺实变，表面呈暗红色。病理学改变表现为局部支气管黏膜上皮欢死、脱落，黏膜炎细胞浸润明显，肺泡腔内有渗出，肺间隔内轻度增宽，为重度间质性肺炎。

106TCID50H7N9 (A/Anhui/1/2013)攻毒后小鼠体重变化率。数据为两次独立实验的均值。

Percentage initial weight loss in miceinfected with 106TCID50of H7N9 (A/Anhui/1/2013). Data are presented as the average values from two independent experiments ± SD(n =10 per group).

H7N9病毒感染后小鼠存活率和体重减轻情况

Survival rate and body weight changes of the mice inoculated with H7N9 virus

小鼠感染后临床症状

Clinicalsignsinthemice

小鼠感染后病毒载量结果

Replication of H7N9 virus in the mice

H7N9感染小鼠组织中病毒载量

Virus titers in the tissues of H7N9 infected mice

注：a鼠以106TCID50剂量感染。b在MDCK中传代三次仍检测不到病毒。c可观察到细胞病变，但TCID50值小于0.5。dNP，不显示。

Note: aMice were infected with influenza viruses at a dose of 106TCID50.bViable virus was not detected after three passages in MDCK cells. cCyotpathic effects were observed but TCID50values were less than 0.5.dNP, Not performed.

小鼠肺部炎症变化情况

Inflammatory changes of the lungs in the mice inoculated with H7N9 virus

注:平均炎症病变面积为每只小鼠病变面积的平均值

Note: Mean inflammation area=mean value of the inflammation area of all mice in a group

(A) 小鼠肺组织的HE染色(100×倍). (B) 通过免疫组化标示的组织中H7N9分布. 感染后第3天，病原使用棕色标记(400×倍).

(A) Hematoxylin and eosin stain (HE) staining of lung tissues from infected mice (100× magnification). (B) Distribution of H7N9 viruses inthe tissues of infected mice as determined by IHC. Representative viral antigen distribution in tissues at 3 dpi is shown. Viral antigens are marked with brown (400× magnification).