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细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信号转导和转录活化因子（STAT） 5 是几乎所有肠道细胞因子，生长因子和生长激素下游转录活化因子 。去除或减少 STAT5 能够导致胚胎干细胞，造血干细胞，肝干细胞，髓样干细胞，以及乳腺干细胞分化异常和组织功能障碍 。
我们实验室报道了敲除肠上皮 STAT5 导致 Lgr5+IESC 再生障碍，上皮屏障缺失，增加肠炎易感性 。相反， 短暂的 STAT5 酪氨酸磷酸化（pYSTAT5） 能够增加Lgr5+肠干细胞再生，保护肠道，减轻实验性肠炎。 但是， STAT5 是否能够调节 IESC 内源性的转录、激活因子，调节何种上游细胞因子以及诱导何种肠上皮分化，还未见报道。因此我们使用特定的 Stat5复合基因工程小鼠与Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，进行肠上皮细胞分化的谱系追踪来确定持续性的 pYSTAT5 激活能够诱导肠道干细胞分化为何种细胞类型。
实验动物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5或 icS5 floxed小鼠
试剂：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA
仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站
实验操作规程：将Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系与Stat5或 icS5 floxed小鼠杂交，分别为对照组（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；实验1组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；实验2组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(扩增目的片段长174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR条件：预变性94℃3min；94℃变性30s，66℃复性1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。实验组小鼠按100mg/kg体重腹腔注射他莫昔芬，对照组小鼠注射等量的玉米油。通过 Tam 诱导， 然后分别在 12 小时和1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉处死各组小鼠。分别取结肠、空肠、回肠组织，用冷PBS冲洗肠道组织，纵向剖开，放入多聚甲醛中固定过夜，制作冰冻切片在子代肠上皮细胞中追踪检测是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能够改变肠上皮中的tdToamto 信号强度和位置.
1、 基因鉴定信息
图1 Lgr5, Rosa26tdTomato基因凝胶电泳鉴定结果
图2 潘氏细胞免疫组织化学染色结果
图3 杯状细胞染色结果
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2023-12-21 15:14:25
