人宫颈癌Hela绿色荧光标记细胞BALB／c裸小鼠肿瘤模型（HelaeGFP）

Hela细胞是典型的永生化细胞系，是人上皮细胞，源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞，此细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒 (Human Papillom avirus 18或HPV 18 )转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈癌细胞有许多不同，此细胞显角蛋白免疫沉淀染色阳性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB表达和p53的低水平表达。该细胞是一种体外培养环境中仍具有接触抑制行为的贴壁细胞，然而接触抑制行为的丧失是细胞癌变的表现之一，即细胞能够在实验动物中成瘤，并且可成多层生长。因此，Hela细胞在实验动物中不具有致瘤性，但是病毒致癌基因的转入能够使其具备实验动物成瘤性。Hela细胞具有82条染色体，其中12号染色体4个拷贝数，6、8及17号染色体3个拷贝数。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/c-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/c-nu/+）。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，每窝平均成活3.62只仔鼠，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养：Hela细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin-promotor-eGFP

4.3细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent 转染Hela细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养。

图1表达GFP的Hela细胞株（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图1)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。每周观察一次，裸鼠麻醉后放入活体荧光系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析

4.5肿瘤体积测定：在接种的14、21、28和35d，分别用游标卡尺测量肿瘤块3个互相垂直直径A、B、C，代入下式计算肿瘤块的体积V：V=1／6πABC(V为体积，A、B、C为瘤体的3个互相垂直的直径)，并绘制肿瘤的生长曲线。

4.6肿瘤组织的HE和TUNEL染色：肿瘤生长5周后，剥取出移植瘤，制成石蜡切片并进行HE和TUNEL染色

5.1影像表现

图2 皮下接种Hela-GFP肿瘤生长影像分析

图3 荧光标记肿瘤的生长曲线

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第3周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光光子数成正相关。4周后，由于动物的皮下肿瘤出现了坏死，因此尽管肿瘤体积仍在增加但平均荧光光子数反而呈下降趋势，移植瘤体积与荧光光子数不再有相关性(图2，图3)

5.2肿瘤体积测定结果

图4 Hela移植模型肿瘤卡尺测定结果

1周时肿瘤大小不能用游标卡尺测量，2周时肿瘤进入对数生长期，至5周时移植瘤体积可达474．08 mm ，3周时动物皮肤表面都出现了不同程度的坏死。

5.3肿瘤组织的HE及TUNEL染色

图5 肿瘤组织的HE染色（A，400×）和TUNEL染色（B，400×）

HE染色可见部分肿瘤细胞核染色质匀细，核浆比例大，细胞结构完整，处于分裂期的细胞很少，肿瘤生长速度缓慢。另外，大部分细胞呈现核皱缩、浓染，胞质致密、嗜酸性染色增强(图5A)。肿瘤组织经TUNEL染色，核呈棕黄色，核固缩，染色质凝集成块状或边集，呈现细胞凋亡的特征(图5B)。