人大细胞肺癌H460绿色荧光标记肿瘤模型

　　H460细胞系于1982年由A.F. Gazdar自一个男性大细胞肺癌患者的胸腔积液中培养获得。与普通肺癌细胞相比，该细胞具有较高水平的p53 mRNA的表达并且无总DNA结构异常。免疫酶标染色显示，该细胞具有角蛋白和波形蛋白阳性反应，但神经丝三联体蛋白反应阴性。该细胞是人亚三倍体细胞系，典型的染色体数是57,或者58条染色体数细胞也存在一定的比例，X和Y染色体在所有细胞中都存在2个拷贝数。

　　无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

　　本实验中所用鼠种BALB/C-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀与BALB/C-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，窝平均仔鼠成活3.62只，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致

　　模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养：H460细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

4.3细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染H460细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的H460-eGFP细胞系（200×）

　　稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

图4 荧光标记肿瘤生长曲线

　　应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第5周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光光子数成正相关（图3、图4）。